《Stem Cells International》：Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells and Their Derived Extracellular Vesicles Protect Pancreatic Beta-TC-6 Cells From Hypoxia-Induced Injury via miR-539-3p-Mediated Downregulation of CD36 Expression
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本文揭示了骨髓间充质基质细胞（BMSCs）及其分泌的细胞外囊泡（EVs）通过递送miR-539-3p，靶向抑制缺氧β细胞中CD36的表达，进而激活PI3K/AKT信号通路，最终改善细胞活力、抑制凋亡并促进功能恢复的作用机制，为糖尿病β细胞功能障碍的细胞治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。
引言
糖尿病，特别是2型糖尿病（T2D），已成为全球性的重大健康挑战，其发病率与人口老龄化和肥胖率上升密切相关。胰腺β细胞功能障碍是糖尿病发病的核心环节之一，其机制涉及遗传、代谢、环境及分子因素的复杂相互作用。其中，缺氧是导致β细胞功能受损的一个重要因素，可能源于胰岛增生和炎症等状况。缺氧会引发活性氧（ROS）水平升高、内质网（ER）应激和线粒体功能障碍，从而损害β细胞的胰岛素分泌和存活能力。然而，缺氧诱导β细胞损伤的确切机制尚未完全阐明。
骨髓间充质基质细胞（BMSCs）具有多向分化潜能，研究表明其能在体内分化为β细胞，并在动物模型中缓解糖尿病表型。此外，BMSCs通过多种机制促进β细胞再生。旁分泌途径是BMSCs发挥功能的关键方式，除了分泌细胞因子，BMSCs还产生并释放细胞外囊泡（EVs，也称为外泌体），这些EVs能够在多种情境下影响靶细胞。例如，来自月经血MSCs的EVs通过涉及PDX1蛋白的机制，在1型糖尿病（T1D）大鼠模型中增强β细胞再生和功能。类似地，人脐带来源MSCs的EVs在T2D大鼠模型中能减少β细胞损伤并改善胰岛素敏感性。但BMSCs来源的EVs是否能保护β细胞免受缺氧诱导的损伤，仍不清楚。
材料与方法
本研究使用小鼠BMSCs和胰腺β-TC-6细胞系。BMSCs在含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基中培养，β-TC-6细胞在含15% FBS的高糖DMEM培养基中，于常氧条件（37°C, 5% CO2, 21% O2）下培养。缺氧模型通过将β-TC-6细胞置于低氧环境（37°C, 2% O2, 5% CO2）中建立。
BMSC-EVs的纯化通过顺序离心法进行：培养基先经2000 g离心30分钟，再经10000 g离心30分钟（4°C），上清液用0.45 μm滤膜过滤后，于100000 g超速离心60分钟（4°C）。沉淀用预冷PBS重悬，经0.22 μm滤膜过滤，再次100000 g离心60分钟，最终重悬于100 μL冰PBS中。通过透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）对EVs进行表征，并通过蛋白质印迹法（Western blot）检测EV标志物CD9、CD81和CD63的表达。EVs用量通过BCA蛋白测定试剂盒定量。
共培养实验采用Transwell系统，BMSCs与β-TC-6细胞以5:1的比例共培养48小时，或使用50 μg/mL的BMSC-EVs处理β-TC-6细胞。使用GW4869抑制EVs的释放。细胞活力通过CCK-8法检测，细胞凋亡通过Annexin V/PI染色和TUNEL法评估，克隆形成能力通过集落形成实验分析。采用定量实时聚合酶链反应（qPCR）检测mRNA和microRNA（miRNA）表达水平，Western blot检测蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验用于验证miR-539-3p与CD36 3'非翻译区（3'UTR）的相互作用。通过生物信息学数据库（Starbase, TargetScan, MicroT-CDS, mirDIP）筛选靶向CD36的miRNAs，并与GEO数据库中T2D患者下调的miRNAs数据集（GSE168327, GSE189002, GSE196797）进行交叉比对。通过葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验评估β细胞功能。
结果
BMSCs和BMSC-EVs的特征
研究首先确认了BMSCs的多向分化潜能。从BMSCs条件培养基中纯化的EVs，经NTA和TEM分析显示其粒径主要分布在30-140 nm之间，Western blot证实EVs标志蛋白CD9、CD81和CD63表达富集。CFSE标记实验证明BMSC-EVs可被β-TC-6细胞摄取。
BMSCs和BMSC-EVs对缺氧β-TC-6细胞的保护作用
缺氧处理导致β-TC-6细胞活力显著下降，凋亡增加。与BMSCs共培养或使用BMSC-EVs处理，均能显著增强缺氧β-TC-6细胞的活力，并改善其克隆形成能力。Annexin V/PI染色、Western blot（检测Bax, Bcl2, Caspase-3等凋亡相关蛋白）和TUNEL实验结果一致表明，BMSCs和BMSC-EVs能显著减轻缺氧诱导的细胞凋亡。值得注意的是，使用EV分泌抑制剂GW4869预处理BMSCs后，其保护作用被显著削弱，提示BMSCs的保护作用很大程度上依赖于其分泌的EVs。
BMSCs和BMSC-EVs下调缺氧β-TC-6细胞中CD36的表达
缺氧条件下，β-TC-6细胞中CD36的mRNA和蛋白表达水平显著上调，而与β细胞功能相关的基因（如PDX1, NKX6.1, IRS-2, GLUT2）表达下调，UCP2表达上调。与BMSCs共培养或BMSC-EVs处理可逆转缺氧引起的CD36上调和功能相关基因的下调，且GW4869能阻断BMSCs的这种作用。已知CD36可抑制PI3K/AKT信号通路，Western blot结果显示，缺氧降低了磷酸化PI3K（P-PI3K）和磷酸化AKT（P-AKT）的水平，而BMSCs或BMSC-EVs能恢复P-PI3K和P-AKT的水平，此效应同样被GW4869所抑制。使用PI3K/AKT通路抑制剂MK-2206处理，进一步证实该通路在BMSC-EVs保护β细胞功能（通过GSIS指数评估）中的必要性。
靶向CD36的miRNA筛选及miR-539-3p的功能验证
通过生物信息学数据库筛选并与T2D相关数据集交叉，得到三个候选miRNA：miR-155-5p, miR-539-3p和miR-485-3p。qPCR检测发现，缺氧条件下，miR-155-5p和miR-485-3p表达上调，而miR-539-3p表达下调。功能实验显示，miR-539-3p模拟物（mimic）能显著抑制缺氧β-TC-6细胞中CD36的表达，并增强细胞活力；miR-485-3p mimic则促进CD36表达并加剧细胞损伤；miR-155-5p mimic对CD36影响不显著但也能改善细胞活力。双荧光素酶报告基因实验证实miR-539-3p可直接结合CD36 mRNA的3'UTR并抑制其活性。qPCR证实miR-539-3p在BMSC-EVs中高表达。
miR-539-3p抑制剂逆转BMSCs和BMSC-EVs的保护作用
在共培养体系中加入miR-539-3p抑制剂，可抵消BMSCs或BMSC-EVs对缺氧β-TC-6细胞活力的提升作用、克隆形成能力的恢复作用以及抗凋亡作用。在分子水平上，miR-539-3p抑制剂也削弱了BMSCs或BMSC-EVs对CD36表达的抑制、对PI3K/AKT通路的激活以及对β细胞功能相关基因（PDX1, NKX6.1, IRS-2, GLUT2）表达的正向调节。
CD36敲低抵消miR-539-3p抑制的影响
在缺氧β-TC-6细胞中敲低CD36，能够增强细胞活力，改善克隆形成能力，减少细胞凋亡。更重要的是，CD36敲低可以逆转miR-539-3p抑制剂对BMSC-EVs保护作用的负面影响，恢复PI3K/AKT通路的活性，并改善β细胞的功能（表现为GSIS指数的恢复）。这进一步证实了miR-539-3p是通过靶向CD36来发挥其保护作用的。
讨论
本研究证实了BMSCs及其EVs对缺氧β细胞的保护作用，并揭示了其核心机制：BMSC-EVs将miR-539-3p递送至缺氧的β-TC-6细胞中，miR-539-3p通过直接靶向CD36 mRNA的3'UTR抑制其翻译，从而解除CD36对PI3K/AKT信号通路的抑制，最终促进细胞存活、抑制凋亡并部分恢复β细胞功能。CD36作为脂肪酸转运/清道夫受体，其上调可能与缺氧条件下β细胞的脂毒性、氧化应激和代谢功能障碍有关。miR-539-3p的功能具有环境依赖性，其在β细胞缺氧损伤中的特异性作用值得深入探讨。BMSCs与BMSC-EVs在恢复PDX1 mRNA水平等方面效果的细微差异，提示BMSCs可能还分泌其他可溶性因子与EVs协同作用。本研究主要聚焦于细胞存活和凋亡，BMSCs/EVs对β细胞分泌功能的直接影响及其体内效应是未来研究的重要方向。
结论
本研究阐明了一条新的信号轴：BMSCs及其EVs通过传递miR-539-3p，下调缺氧β-TC-6细胞中CD36的表达，进而激活PI3K/AKT通路，从而保护细胞免受缺氧损伤。这一发现不仅深化了对BMSCs保护β细胞机制的理解，也为开发针对miR-539-3p-CD36轴的治疗策略，以增强BMSCs及其EVs在糖尿病治疗中的疗效，提供了新的思路和潜在靶点。
