《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Nicotine Regulates LPS-Induced Inflammatory Responses in HMC3 Microglia and Exerts Neuronal Protection
1. 引言
神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病，其特征是中枢神经系统神经元的丧失和功能障碍，导致认知和运动障碍。先天免疫的激活，包括小胶质细胞介导的反应，是这些疾病的重要病理机制。尼古丁作为烟草中的独特生物碱，被发现具有有益的生理效应，包括免疫调节和神经保护作用。流行病学研究表明，吸烟行为与帕金森病的较低风险相关，这可能归因于尼古丁的抗炎作用。然而，目前关于尼古丁调节中枢神经系统免疫炎症的能力的研究有限且尚无定论。
为了研究尼古丁潜在的神经炎症抑制和间接神经保护作用，本研究建立了由人源小胶质细胞和神经元组成的共培养系统，使用HMC3人小胶质细胞系作为模型。小胶质细胞是驻留在中枢神经系统的免疫细胞，通过各种受体与微环境相互作用，包括α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nAChR），它是胆碱能抗炎通路的关键靶点。此外，PI3K是一种参与细胞生长、增殖、凋亡和自噬的细胞内磷脂酰肌醇激酶，也参与神经免疫调节。
2. 材料与方法
2.1. 材料
尼古丁（纯度>99%）购自国家烟草质量监督检验中心。LPS购自Sigma-Aldrich。GTS-21二盐酸盐（一种α7 nAChR特异性激动剂）和柠檬酸甲基牛扁亭（MLA）（一种α7 nAChR特异性抑制剂）购自MedChemExpress。
2.2. 细胞培养与处理
HMC3细胞系购自普诺赛生命科学技术有限公司，培养于补充了10%胎牛血清的最低必需培养基（MEM）中。SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系来自烟草生物效应重点实验室，培养于由一半MEM和一半Ham‘s F-12K培养基混合并补充10%胎牛血清和10 μM丙酮酸钠的培养基中。细胞在37°C、5% CO2的加湿培养箱中培养。培养基每2天更换一次。HMC3细胞暴露于不同浓度的LPS（0、0.1、1、10和100 μg/mL）24小时。在后续实验中，HMC3细胞暴露于10 μg/mL LPS 24小时。
在给药前，将HMC3细胞（2 × 105/mL）加入孔板中。经过12小时的饥饿处理后，从孔板中吸出培养液用于后续实验。细胞分为七个处理组：空白对照组（Con）、模型组（Mod）、尼古丁给药组（低、中、高剂量）（Low、Med、High）、阳性对照组（Pc）和阴性对照组（Nc）。空白对照组细胞用无血清MEM培养；模型对照组用含有10 μg/mL LPS的MEM培养基培养。尼古丁给药组和阳性对照组分别用含有1、10和100 μM尼古丁以及100 μM GTS-21的MEM培养基培养1小时，然后加入含有10 μg/mL LPS的MEM培养基继续培养。阴性对照组先用10 μM MLA培养30分钟，然后用100 μM尼古丁培养1小时，最后向MEM培养基中加入10 μg/mL LPS。所有七组在培养24小时后收集其培养基和细胞。
2.3. 细胞活力测定
使用Cell Counting Kit-8评估HMC3细胞活力。使用MTT法评估SH-SY5Y细胞的活力。
2.4. 酶联免疫吸附测定
收集HMC3细胞并离心获得上清液，然后根据制造商说明书检测上清液中IL-6、BDNF和GNDF的含量。
2.5. 细胞因子和趋化因子测定
使用Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay测定HMC3细胞培养上清液中27种人细胞因子和趋化因子的水平。
2.6. 格里斯试剂盒测定亚硝酸盐
使用Griess试剂盒检测细胞上清液中的亚硝酸盐，亚硝酸盐是NO在生理条件下自发氧化形成的稳定产物。
2.7. NO合酶活性测定
使用试剂盒通过荧光法检测活细胞中NO合酶的活性。该试剂盒利用NO荧光检测探针DAF-FM DA，该探针可以穿透细胞膜，用于检测在底物充足条件下细胞内NO合酶催化形成的NO量，从而说明NO合酶的活性。
2.8. mRNA提取和qPCR
使用SteadyPure Universal RNA Extraction Kit从富含小胶质细胞的培养物中提取总RNA。使用Evo M-MLVRT Premix将提取的RNA反转录成单链cDNA。使用Light Cycler 96进行qPCR反应。采用比较CT法确定mRNA表达水平。每个样品中靶mRNA的量均参照内参基因GAPDH进行标准化。
2.9. 蛋白质提取和Western Blot
在LPS给药后4小时收集各组HMC3细胞，使用RIPA细胞裂解液通过离心收集总细胞内蛋白。使用BCA试剂盒测定并平衡各组的蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，并转移至聚偏二氟乙烯膜。然后使用5%脱脂牛奶在1×TBST中于室温封闭膜2小时。随后将膜与以下一抗分别孵育过夜：Phospho-PI3 Kinase p85/p55 Rabbit mAb (E3U1H)、PI3 Kinase p110α Rabbit mAb (C73F8) 和GAPDH。然后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG在室温下孵育1小时。最后使用ECL试剂盒显影蛋白条带，并使用VosionCapt系统进行拍照和定量。
2.10. 共培养系统的构建
使用transwell板构建小胶质细胞-神经元共培养系统。将人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y放入transwell小室中，将HMC3细胞加入培养板中。分别过夜培养后，将transwell小室放入培养板中并分组进行药物处理。24小时后，取出transwell小室，吸出小室中的培养液。然后使用MTT法检测小室中的培养液和SH-SY5Y神经元细胞活性。
2.11. 统计分析
使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。组间差异的显著性通过单因素方差分析确定。结果以平均值±标准差表示。所有实验至少重复三次，统计学显著性定义为p < 0.05。
3. 结果
3.1. LPS和尼古丁对HMC3细胞活力的影响
CCK-8法用于探讨LPS和尼古丁对HMC3小胶质细胞的潜在毒性。结果表明，浓度范围为0.01至100 μg/mL的LPS以及1–1000 μM的尼古丁在相应的处理时间内不影响HMC3细胞活力。用尼古丁（2000 μM）处理后，HMC3细胞的活性显著降低，这表明高浓度尼古丁对HMC3细胞具有细胞毒性，后续实验中尼古丁的浓度应控制在不超过1000 μM的范围内。
3.2. 尼古丁改善LPS诱导的HMC3细胞炎症
为了观察体外炎症模型，将LPS与HMC3细胞在24孔板中共培养24小时。结果表明，与空白对照组相比，浓度为1、10和100 μg/mL的LPS促进了细胞产生IL-6（p < 0.05）。此外，与10和100 μg/mL浓度的LPS共培养后，IL-6的含量急剧增加，且其效果相似。因此，后续实验在我们的HMC3细胞炎症模型中使用10 μg/mL的LPS。
用不同浓度（1、10、100 μM）的尼古丁和100 μM GTS-21（阳性对照组）预处理HMC3细胞1小时后，然后用LPS处理细胞24小时。检测上清液，结果表明，LPS诱导后，IL-6的释放明显增加（p < 0.05），而尼古丁预处理与模型对照组相比减少了细胞IL-6的释放（p < 0.05）。尼古丁的效果与阳性药物GTS-21相似，表明尼古丁具有抗炎作用。因此，后续选择1、10和100 μM作为尼古丁的实验剂量。
3.3. HMC3细胞中的炎症细胞因子和趋化因子
使用Bio-Plex悬浮芯片系统同时检测27种人源炎症因子和趋化因子，以阐明LPS诱导的HMC3细胞炎症因子释放的变化。我们筛选了受尼古丁处理影响的HMC3细胞中的相关炎症因子。27种细胞因子的结果如表2所示。
对来自各组的细胞上清液的27种细胞因子表达谱进行ANOVA分析。结果表明，有13种细胞因子（包括IFN-γ、IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、TNF-α、Eotaxin、MIP-1α和PDGF-BB）在两组间表现出显著差异（p < 0.05）。然而，其余14种细胞因子（IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-17、MCP-1 (MCAF)、RANTES、VEGF、碱性FGF、G-CSF、GM-CSF、IP-10和MIP-1β）的水平在组间无显著差异（p > 0.05）。
在这些细胞因子中，与空白对照组相比，LPS诱导导致HMC3细胞中12种细胞因子显著增加，包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-17、MCP-1 (MCAF)、RANTES、G-CSF、GM-CSF、IP-10和MIP-1β（p < 0.05）。
与模型对照组相比，尼古丁和GTS-21预处理均降低了MCP-1 (MCAF)、RANTES和VEGF的释放水平。1 μM尼古丁和10 μM尼古丁预处理后的MCP-1 (MCAF)水平显著低于模型对照组（p < 0.05）。与模型对照组相比，暴露于1 μM尼古丁、10 μM尼古丁和100 μM尼古丁后，RANTES水平显著降低（p < 0.05）。用10 μM尼古丁处理后，VEGF水平显著低于模型对照组（p < 0.05）。
基于这些结果，我们观察到暴露于GTS-21后这两种细胞因子和三种趋化因子显著减少。这表明激活α7 nAChR可能诱导HMC3细胞中这些炎症因子的变化。尼古丁预处理后的发现与GTS-21一致，表明尼古丁也与α7 nAChR相互作用，这是HMC3细胞中炎症抑制的关键靶点。
3.4. HMC3细胞中NO释放和NOS活性
为了确定LPS诱导是否增强HMC3细胞中NOS酶活性及随后的NO释放，我们收集细胞上清液，使用Griess法检测上清液中的亚硝酸盐（NO的稳定氧化产物），同时使用荧光探针法评估细胞中的NOS活性。
按照实验组处理24小时后，对上清液亚硝酸盐水平进行定量。结果显示，与空白对照组相比，LPS模型组中的亚硝酸盐没有显著增加（p > 0.05），表明LPS诱导并未升高HMC3细胞中的NO水平。为了排除亚硝酸盐未检测到是由于LPS暴露时间造成的可能性，我们进一步进行了诱导期为2、4、8和24小时的时间过程实验，以检查NO合酶活性的潜在时间变化。结果表明，在HMC3细胞中，NO合酶活性并未随着LPS诱导时间的延长而增加（p > 0.05）。总之，这些发现表明，在我们的实验条件下，LPS并未刺激HMC3细胞产生NO，并且尼古丁处理并未改变NO的表达谱。
3.5. HMC3细胞中神经营养因子的表达
为了确定尼古丁暴露是否导致HMC3细胞产生神经营养因子，我们收集细胞上清液，使用酶联免疫吸附法检测BDNF和GDNF的表达。结果表明，与空白对照组相比，LPS诱导导致HMC3细胞中GDNF水平显著降低。相反，尼古丁干预相对于LPS模型组增加了GDNF表达（p < 0.05）。当应用α7抑制剂MLA时，这种增强作用被取消，GDNF水平降低至模型对照组观察到的水平。就BDNF而言，与模型对照组相比，LPS诱导并未显著改变其在HMC3细胞中的水平（p > 0.05）。然而，尼古丁处理组和阳性对照组均表现出BDNF表达显著增加（p < 0.05）。类似地，添加MLA抵消了这种效应，使BDNF水平恢复至模型对照组水平。
尼古丁和选择性α7 nAChR激动剂均提高了HMC3细胞中BDNF和GDNF的表达。这表明α7 nAChR激活可能促进HMC3细胞中神经营养因子的表达，这有助于增强对外周神经元功能的支持。
3.6. HMC3细胞中α7 nAChR的mRNA表达
用尼古丁和α7 nAChR特异性激动剂GTS-21预处理HMC3细胞1小时，然后用LPS诱导2小时。然后提取总细胞内RNA并通过qPCR进行分析。结果显示，与空白对照组相比，LPS刺激并未显著增加α7 nAChR的转录水平（p > 0.05）。相反，用浓度为1、10和100 μM的尼古丁处理显著上调了α7 nAChR的mRNA表达（p < 0.05），其效果与100 μM GTS-21观察到的效果相当。值得注意的是，这种上调并不遵循剂量依赖性模式，表明即使最低浓度的尼古丁（1 μM）也足以激活HMC3细胞中的大多数α7 nAChR。相反，用α7 nAChR特异性拮抗剂MLA处理后，α7 nAChR的mRNA表达受到显著抑制，接近基线水平。这些结果表明，尼古丁干预显著增强了HMC3细胞中α7 nAChR mRNA的转录表达。
3.7. HMC3细胞中PI3K的蛋白表达
根据我们的qPCR结果，浓度为1、10和100 μM的尼古丁诱导了α7 nAChR mRNA表达的相当激活。因此，选择10 μM尼古丁浓度作为WB实验中的实验浓度。按照我们的实验设计给药4小时后，收集蛋白质提取物以评估PI3K磷酸化水平的变化。免疫印迹条带的光密度分析显示，与空白对照组相比，LPS模型组中的p-PI3K/PI3K水平略有增加，尽管这种差异无统计学意义（p > 0.05）。相反，与LPS模型组相比，尼古丁处理组的p-PI3K/PI3K显著增加（p < 0.05）。这种增强作用被添加α7 nAChR抑制剂MLA所取消，MLA将p-PI3K/PI3K降低至与LPS模型组相当的水平（p > 0.05）。
这些结果表明，尼古丁可能通过激活α7 nAChR促进PI3K磷酸化，这种效应可被MLA抑制逆转，表明α7 nAChR的激活影响PI3K蛋白。在LPS处理组中观察到的PI3K磷酸化的适度增加可能反映了细胞对炎症应激的代偿性反应。
此外，我们的发现强调了在信号研究中优化蛋白质检测时间点的重要性。先前的实验发现，PI3K的磷酸化水平在治疗后2小时即可检测到，但在4小时达到较高水平。在较晚的时间点（8-24小时）未观察到该蛋白磷酸化水平的变化。这突显了调节蛋白表达的动力学具有细胞类型和刺激依赖性，应通过时间过程实验凭经验确定。
3.8. 共培养系统中SH-SY5Y的神经元活性
为了模拟中枢神经系统中的神经炎症，使用HMC3小胶质细胞和SH-SY5Y神经元细胞建立了transwell共培养系统。在尼古丁干预组中，HMC3细胞用尼古丁预处理1小时。随后，用LPS刺激HMC3细胞24小时。然后使用MTT法测量SH-SY5Y神经元的神经元活性。结果表明，与空白对照组相比，LPS处理组的神经元活力被显著抑制至约74.3%（p < 0.05）。相反，尼古丁预处理显著将神经元活性恢复至相对于LPS模型组的约85.7%（p < 0.05）。这些结果表明，尼古丁预处理减弱了HMC3细胞中LPS诱导的炎症反应，并且这种免疫微环境的调节可能有助于维持神经元活性。
4. 讨论
在本研究中，通过多种实验方法系统地研究了尼古丁的抗神经炎症作用。共培养实验证明了尼古丁的神经保护潜力并阐明了潜在的信号机制。具体而言，发现尼古丁抑制HMC3细胞中几种炎症相关细胞因子和趋化因子的释放，并促进BDNF和GDNF的表达。此外，在小胶质细胞-神经元共培养系统中，尼古丁处理显著增强了炎症条件下的神经元存活。研究发现，尼古丁可能通过α7 nAChR调节PI3K磷酸化，这可能是其神经保护作用的合理分子基础。
本研究选择人源小胶质细胞系HMC3作为实验模型。虽然许多研究使用了鼠源小胶质细胞系，但对人源小胶质细胞的研究仍然有限，这主要是由于获取原代人小胶质细胞和获得足够数量的挑战。LPS是革兰氏阴性菌外细胞壁的一种成分，通常用于触发免疫激活级联反应并诱导各种细胞、组织和器官的炎症反应。然而，相对较少的研究关注人源小胶质细胞的炎症反应，而探索尼古丁对此类反应调节作用的研究则更少。
使用基于人的模型HMC3细胞，提供了具有临床相关性的见解，可能有助于未来人类神经系统的转化研究。此外，HMC3是研究LPS对激活表型和炎症水平影响的候选模型。此外，我们实施了尼古丁干预，以研究其是否通过α7 nAChR信号传导调节HMC3细胞中的炎症反应，从而有助于阐明其潜在的作用机制。
小胶质细胞生物学中的先前研究主要利用BV2细胞，关注反映小胶质细胞功能状态的炎症标志物。已知小胶质细胞采用两种激活表型：经典激活的促炎表型和替代激活的抗炎表型。为了更好地理解小胶质细胞行为的功能转变，因此许多研究旨在表征不同细胞模型中的这些极化状态。例如，Qichun Zhang等人证明，BV2细胞中乙酰胆碱介导的α7 nAChR激活促进了从促炎表型向抗炎表型的转变。在本研究中，我们检查了各种炎症相关细胞因子和趋化因子，以及NO合酶活性和NO释放，以全面评估小胶质细胞炎症。我们还使用BV2细胞进行了一些测试以方便比较。
为了分析炎症介质，我们采用了悬浮微阵列分析法。这种方法使我们能够识别尼古丁在调节特定炎症因子和趋化因子中先前未报道的作用。我们的研究结果表明，LPS诱导了12种促炎趋化因子的显著升高，表明HMC3细胞对LPS刺激的敏感性。值得注意的是，尼古丁处理导致2种细胞因子和3种趋化因子（即IL-6、IL-17、MCP-1 (MCAF)、RANTES和VEGF）适度但统计学上显著的减少，而在其他因子中未观察到上调。IL-6和IL-17是充分表征的促炎因子。单核细胞趋化蛋白-1激活单核细胞和小胶质细胞，促进炎症介质的分泌。RANTES调节T细胞介导的免疫反应，促进白细胞迁移和浸润，并可能调节细胞生长和分化。VEGF与细胞因子相互作用并促进炎症反应。总体而言，尼古丁降低了HMC3细胞中MCP-1、RANTES和VEGF的表达。这些因子参与小胶质细胞的调节、趋化蛋白聚集和炎症细胞浸润。它们的分泌减少表明，尼古丁可能通过限制免疫细胞在损伤部位的募集和激活来减轻小胶质细胞介导的炎症。
在我们的实验中，LPS诱导既未改变NO合酶活性，也未增加HMC3或BV2细胞中的NO释放。这一发现与几项已发表的研究相矛盾。例如，Marta Garcia-Contreras的团队检测到HMC3细胞中iNOS表达显著上调，Feng Jiang等人报道了HMC3细胞中iNOS和NO释放增加。类似地，Zhao等人描述了原代小胶质细胞中iNOS表达响应LPS的动态时间依赖性变化，在24小时后观察到最高表达。然而，根据Russo等人在一篇已发表的综述中的说法，在基础条件下以及暴露于各种促炎刺激（包括LPS、LPS/IFN-γ、IL-1β、TNF-α，
