可逆的泛素化过程在蛋白质毒性应激下调控HSF1的相分离

《Life Sciences》：Reversible ubiquitination regulates HSF1 phase separation in response to proteotoxic stress

本研究探究了蛋白酶抑制剂PS341诱导下HSF1相分离的泛素化调控机制。通过免疫荧光、FRAP分析及质谱鉴定泛素化位点，发现E3泛素连接酶STUB1促进HSF1相分离，而DUBs USP13和ATXN3起抑制作用。泛素化位点的突变显著削弱相分离，证实多泛素化位点协同驱动HSF1相分离，并受STUB1与USP13、ATXN3的协同调控。

　　

朱越|王建华|唐淑红|李志强|王瑞林|王鹏|李佳宇|程绍轩|刘涵|张英秋|戴兆霞|闫启涛|刘书岩

中国大连医科大学大连第五人民医院

摘要

目的

热休克因子1（HSF1）在蛋白质毒性应激下会发生相分离，形成核凝聚体，从而调控细胞命运。蛋白质泛素化是一种普遍存在的翻译后修饰方式，并且与液-液相分离过程密切相关。然而，泛素化在HSF1凝聚体形成中的确切作用仍不清楚。本研究旨在探讨蛋白质毒性条件下泛素化对HSF1相分离的调控作用。

材料与方法

通过免疫荧光检测方法检测内源性和外源性HSF1凝聚体的形成。利用荧光恢复后光漂白（FRAP）分析技术研究HSF1的相分离特性。通过Western blotting、免疫荧光、免疫沉淀和共转染实验鉴定调控HSF1相分离的E3泛素连接酶和去泛素化酶（DUBs）。通过定点突变研究泛素化位点对HSF1相分离的影响。

主要发现

蛋白酶体抑制剂PS341能够诱导HSF1以时间依赖的方式形成核凝聚体。E3泛素连接酶STUB1通过增强HSF1的泛素化促进其相分离，而DUBs USP13和ATXN3则抑制HSF1的凝聚。HSF1上所有九个泛素化位点的突变均显著抑制了凝聚体的形成，单个位点的突变也显著减弱了相分离现象。

意义

在蛋白质毒性应激条件下，多个赖氨酸残基上的泛素化共同驱动HSF1的相分离，这一过程由E3泛素连接酶STUB1以及DUBs（包括USP13和ATXN3）协同调控。

引言

为了在各种应激条件下生存，真核细胞发展出了多种应激响应机制来保护自身免受损伤[1]。热休克因子（HSFs）是一类转录调节因子，最初在细胞对热休克应激的反应中被发现[2],[3],[4]。热休克因子1（HSF1）是HSFs中表达最广泛且研究最深入的成员，通常通过与热休克蛋白70（HSP70）结合而保持不活跃状态[2],[5]。在热休克条件下，HSF1从HSP70中释放出来，与热休克元件（HSE）结合，这些元件作为增强子激活一系列分子伴侣基因的转录[6],[7]。有趣的是，除了调节热休克反应外，HSF1还被发现能响应由蛋白酶体抑制引起的蛋白质毒性应激[8]。最新研究表明，在蛋白质毒性应激下，HSF1会发生相分离，形成核凝聚体，这一过程调控细胞命运并与细胞死亡密切相关[9]。然而，蛋白质毒性条件下HSF1凝聚体的调控机制及其翻译后修饰的作用尚未得到充分研究。鉴于HSF1凝聚体在细胞存活中的重要性，进一步研究其调控机制将有助于理解细胞命运与HSF1相分离特性之间的联系。

蛋白质泛素化是一种普遍存在的翻译后修饰方式，在许多细胞过程中发挥重要作用，如蛋白质降解、生物凝聚体的形成和信号转导[10]。泛素分子与底物蛋白的结合受到E3泛素连接酶和去泛素化酶（DUBs）的协同调控[11],[12]。研究表明，泛素化可以通过促进或抑制作用来调控液-液相分离。例如，泛素适配蛋白UBQLN2的相分离受到泛素化的干扰；而包含自噬受体p62的生物凝聚体的形成则通过连接在赖氨酸63或甲硫氨酸1上的泛素链得到增强[13],[14]。然而，泛素化在HSF1凝聚体形成中的确切作用仍不明确。蛋白酶体是处理泛素化蛋白底物的核心枢纽，其抑制会导致包括HSF1在内的多种泛素化蛋白的积累[15],[16],[17]。因此，这些证据和最新进展激发了我们探究蛋白质毒性应激条件下泛素化对HSF1相分离调控作用的兴趣。

在本研究中，我们确认了蛋白质毒性应激条件下HSF1凝聚体的动态特征。除了研究已知E3泛素连接酶对HSF1相分离的影响外，我们还筛选了潜在的DUBs对HSF1凝聚体的调控作用。通过质谱鉴定HSF1上的泛素化位点并进行定点突变，我们研究了每个赖氨酸残基上泛素化的影响。观察结果表明，在蛋白质毒性应激条件下，泛素化显著促进了HSF1的相分离能力，这一过程由E3泛素连接酶STUB1以及DUBs（包括Ubiquitin Specific Protease 13（USP13）和Ataxin-3（ATXN3）协同调控。

抗体和试剂

本研究使用的抗体和试剂如下：抗HSF1抗体（Proteintech，51034-1-AP）用于Western blotting（WB）的稀释比例为1:1000，用于免疫荧光（IF）的稀释比例为1:200；抗GAPDH抗体（Proteintech，60004-1-lg）、抗USP13抗体（Proteintech，16840-1-AP）和抗STUB1抗体（Proteintech，55430-1-AP）分别用于WB的稀释比例为1:1000、1:1000和1:1000；抗V5抗体（Life Technologies，R960-25）用于WB（1:1000）和IF（1:100）；抗Flag抗体（Sigma，F1804-1MG）也用于实验。

蛋白酶体抑制剂PS341诱导多种细胞中的HSF1相分离

已有研究表明蛋白酶体抑制可诱导HSF1凝聚体的形成。我们首先使用蛋白酶体抑制剂PS341处理肺癌和肝癌细胞，评估了内源性HSF1的相分离特性。免疫荧光检测显示，HSF1在肺腺癌细胞H1299中以时间依赖的方式形成核凝聚体，表现为具有凝聚体的细胞比例增加以及每个细胞中凝聚体数量的增加（图1A）。此外，HSF1凝聚体...

讨论

液-液相分离在多种生理过程中发挥作用，既可能促进肿瘤生长也可能抑制肿瘤发展。本文重点研究了蛋白质毒性条件下HSF1相分离的调控机制，并证明了PS341诱导的HSF1相分离依赖于其多个赖氨酸残基上的泛素化。E3泛素连接酶STUB1和DUBs（包括USP13和ATXN3）在调控过程中起协同作用...

缩写

HSFs
热休克因子
HSF1
热休克因子1
HSP70
热休克蛋白70
HSE
热休克元件
DUBs
去泛素化酶
STUB1
STIP1同源蛋白和Ur-Box含蛋白1
USP13
Ubiquitin Specific Protease 13
ATXN3
Ataxin-3
PS-341
Bortezomib
FRAP荧光恢复后光漂白
SEM平均值的标准误差

CRediT作者贡献声明

朱越：撰写原始草稿、数据可视化、方法设计、实验实施、数据整理。王建华：数据可视化、方法设计、实验实施、数据整理。唐淑红：数据可视化、方法设计、数据整理。李志强：方法设计、数据整理。王瑞林：方法设计、数据整理。王鹏：方法设计、数据整理。李佳宇：方法设计、数据整理。程绍轩：方法设计、数据整理。刘涵：方法设计、数据整理。张英秋：方法设计、数据整理。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了辽宁省科学技术厅（项目编号：2024-MS-150，资助对象：SL）、大连生命与健康领域指导项目（项目编号：0122023102，资助对象：QY）、大连科技创新人才项目（项目编号：2024RY004，资助对象：SL）以及中国健康与医学发展基金的支持。