《Life Sciences》：Exogenous hydrogen sulphide alleviates diabetes-associated cognitive decline by inhibiting ferroptosis through Nrf2/GPX4 signalling pathway
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外源性硫化氢通过激活Nrf2/GPX4信号通路抑制铁死亡改善糖尿病认知衰退。研究显示STZ诱导糖尿病小鼠经NaHS处理后认知功能恢复，铁代谢相关指标及线粒体结构改善，而Nrf2抑制剂ML385可逆转上述效应。
魏华|孙一磊|孙明泽|刘怡颖|孙红雪|陈慧楠|马水源
哈尔滨医科大学第一附属医院病理学系，中国黑龙江省哈尔滨市
摘要
目的
神经元铁死亡（ferroptosis）影响糖尿病相关认知衰退（diabetes-associated cognitive decline, DACD）的发病机制。外源性硫化氢（H?S）治疗可改善糖尿病小鼠的认知缺陷。本研究旨在探讨H?S是否通过激活Nrf2/GPX4信号通路来抑制铁死亡，从而发挥神经保护作用。
材料与方法
STZ诱导的糖尿病小鼠接受NaHS或NaHS联合Nrf2抑制剂ML385的治疗，随后使用Morris水迷宫测试评估其认知功能。通过透射电子显微镜、苏木精-伊红（H&E）染色、Nissl染色和免疫荧光染色观察海马神经元损伤和线粒体形态变化。使用检测试剂盒测定活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和铁的含量。Western blotting用于检测Nrf2/GPX4轴、铁转运相关蛋白和GSH合成酶的表达情况。
主要发现
外源性H?S治疗通过减轻海马神经元丢失和改善突触超微结构完整性来改善认知缺陷。NaHS处理后，ROS、MDA和铁的水平降低，而SOD、GSH和Nrf2/GPX4的表达增加。外源性H?S还改善了海马神经元的线粒体损伤并抑制了铁死亡。然而，这些神经保护作用被ML385所消除。同时接受ML385和NaHS治疗的糖尿病小鼠表现出更长的逃避潜伏时间和在目标象限停留时间缩短。此外，ML385与NaHS联合使用会加剧神经元损伤、氧化应激、突触超微结构异常和铁代谢紊乱，并下调Nrf2/GPX4表达，抑制铁死亡的抑制作用。
意义
外源性H?S通过激活Nrf2/GPX4信号通路抑制铁死亡，从而缓解糖尿病相关认知衰退（DACD）。
引言
糖尿病相关认知衰退（DACD）是糖尿病的主要并发症，表现为学习和记忆的逐渐进展性缺陷[1]。多种病理机制导致DACD的发展，包括氧化应激、线粒体功能障碍和神经炎症[2][3]。然而，DACD的确切机制和有效的治疗策略尚未充分阐明。
铁死亡是一种依赖铁的程序性细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化和活性氧（ROS）的积累[4]。铁死亡的生化机制与抗氧化系统的失调密切相关，如细胞内抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的失活以及铁的过度积累[4][5]。多项研究表明，铁死亡在DACD的病理生理过程中起重要作用。高血糖已被证明可通过破坏铁代谢和抑制溶质转运蛋白SLC7A11（xCT）/GPX4通路在体内和体外诱导星形胶质细胞的铁死亡[6]。腹腔注射铁死亡抑制剂ferrostatin可改善2型糖尿病（T2DM）小鼠的认知障碍[7]。此外，铁转运蛋白FPN1（唯一已知的参与铁稳态和铁死亡调节的蛋白质）与1型糖尿病大鼠模型的认知功能障碍有关[8]。db/db小鼠的超微结构特征表现为海马区线粒体减少和萎缩、SLC7A11/GPX4表达水平下降以及铁转运相关蛋白异常[9]。
核因子红系2相关因子2（Nrf2）是一种关键的转录因子，参与抗氧化防御，对调控与铁死亡相关的基因（如GPX4和SLC7A11等氧化还原相关基因）以及铁相关基因至关重要[10][11][12]。研究表明，激活Nrf2通路在神经退行性疾病模型中具有神经保护作用[13]。Nrf2/GPX4轴的激活在阿尔茨海默病的体内和体外模型中显示出抗铁死亡和抗神经炎症的作用，为铁死亡与神经炎症之间的关系提供了新的见解[14]。
硫化氢（H?S）是中枢神经系统中的重要气体递质，通过调节氧化应激和炎症发挥神经保护作用[15]。内源性H?S主要通过大脑中的3-巯基丙酮酸硫转移酶（MPST）和半胱硫氨酸-β-合成酶（CBS）生成[16]。研究表明，给予硫化氢钠（NaHS，外部H?S的来源）可通过抑制链脲佐菌素（STZ）处理的糖尿病大鼠的突触超微结构损伤来缓解认知功能障碍[17]。我们之前的研究表明，外源性H?S治疗通过上调Nrf2/血红素加氧酶-1（HO-1）轴的表达和调节线粒体凋亡通路来增强糖尿病动物的空间学习和记忆能力[18][19]。
在本研究中，我们进一步探讨了外源性H?S是否可以通过激活Nrf2/GPX4信号通路来调节铁死亡，从而缓解糖尿病相关认知衰退。
动物与实验组
从长春生物技术有限公司（中国辽宁省）获得4至5周大的雄性C57BL/6小鼠（n=96只），并在特定的无病原体条件下饲养，光照/黑暗周期为12小时，室温为22–25°C。
小鼠被随机分为四组：对照组（n=24只）、STZ诱导的糖尿病组（n=24只）、STZ+NaHS（100 μmol/kg/d）组（n=24只）以及STZ+NaHS+ML385（30 mg/kg）组（n=24只）。
所有动物实验操作均符合伦理标准。
生化指标
在成功建立糖尿病模型后，每周测量四组的空腹血糖（FBG）水平和体重。在处死前检测血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平。
STZ注射后3天，STZ组的FBG水平显著高于对照组。在接下来的四周内，STZ组的FBG浓度持续高于对照组（图1A，每组n=24只小鼠进行FBG测量，P<0.001）。
讨论
我们观察到，外源性H?S治疗对糖尿病诱导的小鼠认知衰退具有神经保护作用，表现为学习和记忆能力的改善。氧化应激、脂质过氧化和铁过载导致海马区的铁死亡、神经元丢失和突触超微结构损伤，这些均可通过外源性H?S治疗得到缓解。Nrf2特异性抑制剂ML385的给药逆转了外源性H?S的神经保护作用。
结论
外源性H?S治疗通过减轻海马神经元丢失和改善突触超微结构损伤，提高了STZ诱导的糖尿病小鼠的空间学习和记忆能力。其作用机制与通过激活Nrf2/GPX4信号通路抑制铁死亡有关，表明H?S可能是DACD的潜在治疗候选物。
CRediT作者贡献声明
魏华：撰写初稿、进行研究。
孙一磊：进行研究、进行正式分析。
孙明泽：进行研究。
刘怡颖：制定方法、进行研究。
孙红雪：进行研究。
马水源：撰写、审稿与编辑、获取资金、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了黑龙江省自然科学基金（编号：QC2015093）、黑龙江省省属高校基本科研经费（编号：2024-KYYWF-0148）以及哈尔滨医科大学第一附属医院科研创新基金（编号：2021L04）的支持。
