《Life Sciences》：Amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles enhance functional recovery of neurogenic bladder and neurovascular plasticity after cerebral ischemia in rats
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人羊水干细胞外泌体治疗脑缺血后神经源性膀胱功能障碍的机制研究。通过给脑缺血大鼠注射hAFSC-EV，显著减少脑梗死体积和血脑屏障破裂，促进缺血脑区神经血管再生，改善膀胱逼尿肌收缩功能及受体表达。摘要：
梁清忠|肖史蒂文·W.|吴贤明|林一豪|谢祖祥|黄永信|李宗海
台湾桃园长庚纪念医院妇产科女性泌尿科
摘要
背景
中风后神经源性膀胱功能障碍会降低患者的生活质量，但目前的治疗方法效果有限。本研究探讨了人羊水干细胞衍生的细胞外囊泡（hAFSC-EV）对脑缺血后膀胱功能障碍和神经血管可塑性的治疗效果及其潜在机制。
方法
36只雌性大鼠接受双侧卵巢切除术，并被分为假手术组或90分钟大脑中动脉阻塞（MCAO）组，其中部分组接受单次hAFSC-EV注射。通过磁共振成像（MRI）、膀胱测压、血脑屏障（BBB）通透性以及缺血脑区的神经发生和血管生成标志物进行评估。在MCAO或假手术后7天和28天，检测膀胱中的脑源性神经营养因子（BDNF）、β3-肾上腺素受体、腺苷酸环化酶以及M2和M3-毒蕈碱受体的水平。
结果
与未接受治疗的大鼠相比，hAFSC-EV治疗显著减少了脑梗死体积和BBB渗漏，并增强了微血管和血管密度，同时促进了血管生成。在MCAO后7天和/或28天，神经标志物如BDNF、nestin和doublecortin显著上调。hAFSC-EV治疗通过降低排尿量峰值、收缩间隔和膀胱容量，以及改善残余尿量，改善了MCAO引起的膀胱功能障碍。hAFSC-EV治疗还显著增加了膀胱中BDNF和M3-毒蕈碱受体的表达，并在MCAO后7天和28天将M2、β3-肾上腺素受体和腺苷酸环化酶的表达恢复到接近对照组水平。
结论
hAFSC-EV治疗通过减少脑梗死体积和BBB损伤、促进缺血脑区的神经发生和血管生成，以及调节膀胱中BDNF、β3-肾上腺素受体、腺苷酸环化酶和毒蕈碱受体的表达，从而改善了MCAO后的神经源性膀胱功能障碍。
引言
脑卒中是全球导致死亡和长期残疾的主要原因之一。中风后的神经损伤是身体功能障碍和神经源性膀胱功能障碍的主要因素。对于急性缺血性卒中，静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）[1] [2] 和动脉内血管内血栓切除术[3] 是标准治疗方法，必须及时实施。然而，rt-PA的治疗时间窗口较窄[1]，且这两种方法都存在出血并发症的风险[4]。
干细胞疗法在延长治疗时间窗口、改善神经功能以及减少脑梗死体积方面显示出潜力[5] [6] [7] [8] [9]。尽管如此，仍存在一些局限性，包括肿瘤形成的风险、微血管阻塞、难以穿过血脑屏障（BBB）以及在缺血脑区的低植入效率[10]。
细胞外囊泡（EVs）是一组异质性的膜结合颗粒，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体，能够穿过BBB，并逐渐被认为是细胞间通讯的媒介[11]。来自干细胞的EVs已被证明具有与其亲本细胞相似的再生和功能效应[12] [13] [14] [15] [16]。它们在调节血管生成、神经发生、炎症和凋亡方面发挥关键作用[17] [18] [19] [20]，并且相比基于细胞的疗法具有更低免疫原性和更低致癌风险[21]。
调节下尿路功能的前额叶和前扣带回皮质常受到局灶性脑梗死的影响[22]。中风引起的神经源性膀胱功能障碍表现为膀胱过度活动、尿失禁和排尿困难等症状[23] [24] [25]。目前的治疗方法往往无效，且可能引起口干和便秘等副作用[26]。
我们之前的研究表明，将人羊水干细胞（hAFSCs）注射到大脑中动脉阻塞（MCAO）大鼠的膀胱中，或在糖尿病大鼠中静脉给药，可显著改善膀胱功能障碍[27] [28]。hAFSCs可以从羊水中轻松获得，易于培养，并保持表型和遗传稳定性，使其成为基于细胞的疗法的有希望的来源[29]。
虽然有一些研究探讨了hAFSC衍生的细胞外囊泡（hAFSC-EVs）在化疗引起的卵巢损伤[30]、骨骼肌萎缩[12] 和阿尔波特综合征[31]中的肾纤维化模型中的再生潜力，但尚未有研究探讨其对中风引起的膀胱功能障碍的影响。为了进一步了解hAFSCs的治疗潜力，Castelli等人[32] 在体外缺血/再灌注模型中研究了hAFSC衍生的分泌组激活的信号通路。尽管这些发现表明激活了促生存和抗凋亡通路，但迄今为止尚未有体内或临床研究评估hAFSC-EVs用于中风治疗的效果。
动物实验和伦理批准
所有涉及动物的程序均经过机构动物护理和使用实验动物伦理委员会审查并批准（批准编号2022121301）。实验方案遵循ARRIVE指南，以确保质量和可重复性。
10-12周大的Sprague-Dawley雌性大鼠在标准化环境条件下饲养（温度21-23°C；湿度47%），具有12小时的光照/黑暗周期，并可自由获取水和标准饲料。
hAFSC-EVs的鉴定
透射电子显微镜（TEM）显示hAFSC-EVs呈双层球形结构，直径范围为50至150纳米（图2A）。Western blot分析确认hAFSC-EVs表面表达有CD63、CD81和CD9蛋白（图2B）。纳米粒子跟踪分析（NTA）进一步验证了大多数hAFSC-EVs的尺寸在50-150纳米范围内（图2C）。
MCAO后hAFSC-EVs减少脑梗死体积
MCAO诱导后7天和28天，MCAO组的纹状体和皮质区域出现明显的脑梗死
讨论
本研究表明，系统性给予hAFSC-EVs在大鼠MCAO模型中具有显著的治疗效果，主要表现在两个方面：hAFSC-EVs不仅减少了脑梗死体积，还改善了MCAO后的膀胱功能障碍。这些治疗效果似乎是通过多种机制实现的，包括保持BBB完整性、促进缺血脑区的神经发生和血管生成
结论
总之，这是首次证明hAFSC-EVs用于治疗大鼠脑缺血引起的神经源性膀胱功能障碍的研究。该研究提供了有力证据，表明hAFSC-EVs是一种有前景的无细胞治疗策略，适用于缺血性卒中及其相关的膀胱功能障碍。hAFSC-EVs通过增强BBB完整性、神经发生和血管生成来减轻脑损伤，并且通过恢复关键功能——膀胱控制——从而改善了主要的功能结果
缩写
- BBB
- 血脑屏障
- BDNF脑源性神经营养因子
- CD31
分化簇31- DAB3,3'-二氨基苯胺
- EVs
细胞外囊泡- hAFSCs
人羊水干细胞- hAFSC-EVs
人羊水干细胞衍生的细胞外囊泡- IBZ
缺血边缘区MCAO | 大脑中动脉阻塞 | M2 | M2-毒蕈碱受体 | M3 | M3-毒蕈碱受体 | MRI | 磁共振成像NTA | 纳米粒子跟踪分析PBS | 磷酸盐缓冲液PVDF | 聚偏二氟乙烯rt-PA | 重组组织型纤溶酶原激活剂
乙烯基聚硅氧烷
（用于MCAO的导管涂层）3.EDTA
（乙二胺四乙酸；用于细胞分离）4.戊二醛
（用于TEM固定）5.甲醛
（用于TEM和免疫荧光固定）6.卡科丁酸
（用于TEM固定缓冲液）7.铀酰醋酸盐
（用于TEM负染色）8.丙酮
（用于免疫组化固定）9.3,3'-二氨基苯胺（DAB）
（用于染色）10.过氧化氢
CRediT作者贡献声明
梁清忠：撰写——初稿、验证、资源获取、项目管理、资金筹集、概念构思。肖史蒂文·W.：可视化、验证、监督。吴贤明：软件使用、实验研究。林一豪：监督、实验研究。谢祖祥：监督、实验研究。黄永信：方法学、数据分析、数据管理。李宗海：撰写——审稿与编辑、验证、资源获取、资金筹集
出版同意
不适用。
伦理批准和参与同意
所有实验方案均获得我们医院动物护理和使用实验动物伦理委员会的批准（编号2022121301）。
hAFSCs的收集、分离和培养也获得了我们医院伦理审查委员会的批准（IRB编号202202027A3）。
资助
本研究由台湾科技部资助：MOST 109-2314-B-182A-091（CC Liang）和NSTC 112-2314-B-182A-062（CC Liang），以及MOST 111-2314-B-182A-144-MY3（TH Lee）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢台湾长庚纪念医院显微镜核心实验室的技术支持，同时也感谢该医院的实验动物中心在动物饲养和分子成像技术方面的支持。
