《Materials Today Bio》：Intravesical folate-conjugated hydroxyethyl starch micelles for pH-triggered co-delivery of epirubicin and TLR7 agonist toward synergistic chemoimmunotherapy of bladder cancer
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为破解膀胱癌术后灌注药物滞留短、免疫抑制强、复发率高的困境，沈阳药科大学团队构建叶酸靶向羟乙基淀粉胶束共递送EPI与IMQ。该pH响应纳米粒在酸性肿瘤微环境同步释放化疗与免疫药物，原位大鼠模型肿瘤抑制率96.7%，显著优于单药，且系统毒性低，为NMIBC术后化免联合灌注提供可转化新策略。
膀胱癌是全球泌尿系统第二大恶性肿瘤，其中约75%–85%为非肌层浸润型（NMIBC）。经尿道肿瘤切除术（TURBT）后需立即灌注化疗以降低复发，但传统药物因尿液冲刷、靶向性差、尿路上皮毒性大，5年内复发/进展率仍高达70%。更棘手的是，膀胱肿瘤微环境（TME）呈高度免疫抑制，M2型肿瘤相关巨噬细胞（M2-TAM）占主导，阻碍化疗诱导的抗肿瘤免疫，成为术后反复复发的“帮凶”。如何延长药物膀胱滞留、精准杀伤肿瘤并重编程免疫微环境，是临床亟待突破的瓶颈。
为回答上述难题，沈阳药科大学Yuxiu Wang、Haoyang Yuan等人在《Materials Today Bio》报道了一种“化免双剑”策略：以羟乙基淀粉（HES）为骨架，化学偶联叶酸（FA）与表柔比星（EPI），并物理包载TLR7激动剂咪喹莫特（IMQ），自组装成约95 nm的FA-HES-EPI/IMQ胶束。该纳米粒利用叶酸受体（FR）介导的内吞实现肿瘤主动靶向，酸敏腙键在肿瘤微环境（pH≈6.5）断裂，同步释放EPI与IMQ，既放大化疗诱导的免疫原性细胞死亡（ICD），又通过TLR7-MyD88-NF-κB轴激活M1型巨噬细胞，实现“化疗杀伤+免疫唤醒”协同。
作者采用的关键技术包括：①化学合成与1H-NMR、FTIR、UV-Vis表征HES-CHO、FA-HES-hyd-EPI中间体；②纳米沉淀法制备胶束，DLS、TEM表征粒径/形貌，HPLC测定载药量；③透析法评价pH 7.4/6.5/5.0释放；④FR高表达T24膀胱癌细胞、RAW264.7巨噬细胞及NIH 3T3正常细胞体外摄取、毒性、凋亡与巨噬细胞极化实验；⑤IL-4诱导M2-TAM模型，流式与免疫荧光检测CD86/CD206比例及细胞因子IL-6、TNF-α；⑥Western blot验证TLR7/MyD88/p-NF-κB p65信号；⑦MNU诱导大鼠原位膀胱癌模型，每周一次膀胱灌注共6周，评估肿瘤重量、组织学（H&E、TUNEL、Ki67）、EPI荧光分布、免疫荧光分析TAM表型（iNOS/CD163）及基质成分（Masson、Collagen I、Fibronectin）；⑧系统毒性通过体重记录与主要器官H&E染色评价。
研究结果如下：
3.1 胶束制备与表征
成功合成FA-HES-hyd-EPI两亲性前药，自组装成球形胶束，粒径90–95 nm，PDI<0.2，Zeta电位约?25 mV；IMQ载药量0.98%，EPI载药量20.5%，48 h内粒径稳定，4 ℃储存30 d无变化。
3.2 pH响应释放
腙键在pH 5.0时断裂，120 h EPI累计释放72–75%，IMQ释放同步加快；模拟膀胱尿液pH 6.5条件下2 h内EPI与IMQ泄漏分别仅4.2%与13.8%，满足临床灌注停留要求。
3.3 细胞摄取与靶向
FA修饰使T24细胞摄取提高2倍，游离FA竞争抑制证实为叶酸受体介导；氯丙嗪与NaN显著抑制摄取，提示依赖网格蛋白与能量的内吞途径。
3.4 体外毒性与凋亡
FA-HES-EPI/IMQ对FR高表达T24细胞IC最低，而对FR低表达NIH 3T3毒性明显降低；凋亡率37.65%，高于FA-HES-EPI（27.52%），显示IMQ增强细胞死亡。
3.5 巨噬细胞再极化
FA-HES-EPI/IMQ使IL-4诱导的M2-TAM向M1转化，CD86平均荧光强度提高，CD206降低；IL-6分泌量提高7.8倍，p-NF-κB p65上调，证实TLR7通路激活。
3.6 体内抗肿瘤效果
原位大鼠模型中，FA-HES-EPI/IMQ组肿瘤抑制率96.7%，显著高于FA-HES-EPI（86.6%）与游离EPI（62.3%）；肿瘤坏死、凋亡增加，增殖降低；EPI荧光强度提高1.5倍，表明叶酸靶向增强药物蓄积。
3.7 免疫微环境重塑
FA-HES-EPI/IMQ显著增加iNOS M1-TAM、减少CD163 M2-TAM；CD4与CD8 T细胞浸润增多，CD4FOXP3 Treg减少；Masson染色显示胶原面积下降58.5%，Collagen I与Fibronectin表达显著降低，提示基质重塑、药物渗透改善。
3.8 体内安全性
FA-HES-EPI/IMQ组大鼠体重持续增长，未见心脏、肝、脾、肺、肾组织病理损伤，游离EPI组出现局灶性心肌坏死，表明纳米制剂显著降低系统毒性。
结论与讨论
该研究构建的FA-HES-EPI/IMQ pH响应纳米平台首次实现膀胱癌术后灌注“化疗-免疫”同步协同：①叶酸受体靶向提高肿瘤药物浓度；②酸敏腙键确保尿液环境稳定、肿瘤微环境触发释放；③EPI诱导ICD提供抗原，IMQ激活TLR7/MyD88/NF-κB轴，促进M2→M1巨噬细胞再极化，增强CD8 T细胞浸润，削弱Treg与致密基质屏障，形成“免疫热”微环境；④原位模型中肿瘤抑制近97%，系统毒性低，为NMIBC术后化免联合灌注提供可直接转化的新策略。未来需进一步提高IMQ载药量、评估反复膀胱给药免疫原性，并在更大动物模型验证，以推动临床开发。
