具有成骨-血管生成耦合功能的多级适应性3D生物打印支架促进血管化骨再生

《Materials Today Bio》：Synergistic 3D-bioprinted scaffold with multi-level adaptability for vascularized bone regeneration via osteogenesis-angiogenesis coupling

本研究针对现有骨修复支架存在力学强度不足、血管化能力弱等问题，开发了一种基于双喷头协同3D生物打印技术的多功能复合支架。该支架通过模拟编织图案，将负载BMP-4/DMOG的功能化纳米颗粒嵌入GelMA/GGMA水凝胶（软组分），并与掺入MgO纳米颗粒的PCL（硬组分）有机结合，实现了良好的孔隙结构和力学性能。体外实验证实该支架能显著促进HUVECs的血管生成行为和BMSCs的成骨分化，大鼠颅骨缺损模型显示其可有效增强血管化和骨再生。这项工作为通过成骨-血管生成耦合策略修复骨缺损提供了有前景的新方法。

　　

骨作为具有多种生理功能的结缔组织，其缺损是临床常见的骨科疾病，通常由感染、创伤或肿瘤切除引起。尽管经过数十年的组织工程发展，3D打印骨缺损修复支架因其高度定制化和良好生物相容性而显示出巨大潜力，但现有支架仍面临血管化不足、骨诱导能力弱、力学强度不匹配等问题。特别是由单一水凝胶组分构成的支架往往存在力学强度弱、缺乏多功能性等固有缺点，而通过增加水凝胶浓度来提高力学强度又会限制细胞迁移、增殖和血管生成。此外，水凝胶支架的化学稳定性较差，其降解行为可能与新骨形成速率不匹配，影响体内修复效果。因此，利用3D生物打印策略开发能够良好适应骨再生过程的高活性骨修复支架仍然是一个重大挑战。

在这项发表于《Materials Today Bio》的研究中，研究人员受到编织图案的启发，采用双喷头协同3D打印技术，制备了一种用于骨缺损修复的多级匹配生物复合支架。该支架系统将柔软的甲基丙烯酰化明胶/甲基丙烯酰化结冷胶(GelMA/GGMA)基生物墨水打印的软微丝，与掺入氧化镁(MgO)纳米颗粒的聚己内酯(PCL)复合材料打印的硬微丝交替集成。为了实现在单个纳米载体上共同递送成骨和血管生成因子，研究人员制备了功能化的可生物降解介孔二氧化硅纳米颗粒(bMSN)，通过聚电解质修饰使其表面吸附成骨蛋白BMP-4，孔内封装血管生成药物DMOG。同时，将MgO纳米颗粒掺入PCL基质中，不仅提高了复合支架的力学强度，还能通过持续释放Mg²⁺来补偿血管生成/成骨活性。

研究团队采用了几项关键技术方法：双喷头协同3D生物打印技术构建软硬交替的复合支架结构；聚电解质层层自组装技术修饰介孔二氧化硅纳米颗粒实现BMP-4和DMOG的时空控制释放；甲基丙烯酰化改性制备光交联GelMA/GGMA生物墨水；以及大鼠临界尺寸颅骨缺损模型评估体内骨再生效果。研究使用的BMSCs来自SD大鼠的股骨和胫骨骨髓腔。

3.1. 纳米颗粒表征

研究人员成功合成了具有树枝状孔道的bMSN，并通过聚电解质修饰实现了表面电荷的交替变化。透射电镜显示修饰后纳米颗粒的孔结构变得不明显，表面被聚电解质覆盖。

3.2. 水凝胶表征

通过¹H NMR和FTIR验证了GelMA和GGMA的成功合成。流变学测试表明，7%GelMA/2%GGMA生物墨水具有适宜的凝胶温度和剪切稀化特性，适合挤出式打印。力学测试显示GGMA的加入显著提高了水凝胶的压缩应力和压缩模量。

3.3. MgO含量的确定

通过活死细胞染色和细胞增殖定量分析，发现含5%-20%MgO的3D打印MgO@PCL支架均具有良好的细胞相容性。体外血管生成实验表明，10%MgO掺入量的支架表现出最佳的促血管生成效果。

3.4. 复合支架表征

确定1.2mm的丝间距可实现水凝胶和PCL丝的紧密结合而无重叠。扫描电镜显示复合支架呈现网格状结构，MgO@PCL/M-bMSN@GG复合支架的压缩性能显著优于P/GG支架，力学强度达到人类松质骨水平。药物释放研究表明，BMP-4呈现快速释放模式，而DMOG和Mg²⁺则呈现缓释行为。

3.5. 体外血管生成评估

CCK-8和活死染色证实协同打印的复合支架具有良好的生物相容性。划痕实验和Transwell迁移实验表明，MgO@PCL/BD@GG支架能显著促进HUVECs的迁移。体外成管实验显示，该支架组具有最多的血管参数（网格数、主段数和连接点数）。RT-qPCR结果显示，MgO@PCL/BD@GG组能显著上调CD31、HIF-1α和VEGF等血管生成相关基因的表达。

3.6. 体外成骨评价

碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红S(ARS)染色表明，MgO@PCL/BD@GG支架能显著促进BMSCs的成骨分化和矿化结节形成。RT-qPCR检测显示，该支架组能诱导骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)和I型胶原(COL-1)等成骨相关基因的最高表达水平。Western blot分析证实，BMP-4和DMOG能分别有效促进BMSCs中Smad1/5/8磷酸化和HUVECs中Akt磷酸化以及HIF-1α和VEGF蛋白表达。

3.7. 体内骨再生评价

大鼠颅骨缺损模型 Micro-CT分析显示，植入12周后，MgO@PCL/BD@GG组的骨体积分数(BV/TV)显著高于其他支架组。组织学染色（H&E和Masson）表明，该支架组缺损区几乎完全被新生骨组织覆盖。免疫荧光染色进一步证实，MgO@PCL/BD@GG组在缺损部位具有最高的OPN、OCN、HIF-1α、CD31和α-SMA阳性表达面积百分比，表明其能有效促进成骨-血管生成耦合。

本研究成功构建了一种具有成骨-血管生成耦合功能的软硬结合生物复合支架，通过双喷头协同3D生物打印技术实现了多级适应性设计。该支架不仅能提供适宜的微观结构和长期力学支持，还能通过BMP-4、DMOG和Mg²⁺的时空控制释放，有效促进血管化骨再生。研究证实，该支架可通过激活Smad1/5/8和PI3K/Akt信号通路增强成骨-血管生成耦合，为骨缺损修复提供了新的治疗策略。值得注意的是，除了直接作用于成骨和血管生成外，Mg²⁺还能通过调节巨噬细胞极化和神经微环境间接促进骨再生，这为未来研究提供了新的方向。然而，该多材料系统在临床转化中仍面临大规模制备、储存稳定性等挑战。总体而言，这项工作为制备具有多级适应性的成骨-血管生成耦合生物复合支架提供了创新策略，在骨组织工程领域具有重要应用前景。