《Materials Today Bio》：Ultrasound-responsive CPS piezoelectric hydrogel synergistically repairs annulus fibrosus defects through immune reprogramming and cell recruitment
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本研究针对纤维环(AF)修复中微环境失衡、细胞再生不足和机械稳定性差三大瓶颈，开发了由二氧化铈(CeO2)、聚-L-乳酸(PLLA)纤维和海藻酸钠(SA)构成的超声响应压电水凝胶支架(CPS gel)。该支架通过CeO2清除活性氧(ROS)驱动M2型巨噬细胞极化实现免疫调控，利用超声激活PLLA压电效应通过ITGβ1/PI3K/AKT/ERK通路促进细胞迁移/增殖，并借助SA"蛋盒"网络提供生理匹配的机械支撑。体内实验证实其能有效恢复椎间盘压缩刚度，为AF结构性再生提供了新策略。
腰痛是全球范围内致残的主要原因，而其病理核心常常是椎间盘突出导致的纤维环（Annulus Fibrosus, AF）结构破坏。纤维环是包裹椎间盘髓核（Nucleus Pulposus, NP）的坚韧带状结构，一旦受损，不仅难以自行愈合，还可能导致髓核再次突出压迫神经，使得患者症状复发，再手术率可高达24%。传统的腰椎间盘切除术虽然能暂时解除神经压迫，却无法有效修复纤维环的缺损，甚至缝合技术还可能加重组织损伤。因此，如何实现纤维环的结构与功能再生，是脊柱外科领域面临的重大挑战。
纤维环修复面临三大科学瓶颈：首先是微环境失衡，损伤局部会产生过量的促炎细胞因子和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），形成恶劣的微环境，抑制细胞活性并加速细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）降解；其次是细胞再生能力不足，纤维环本身细胞密度极低，固有修复能力有限；最后是机械稳定性差，椎间盘在日常活动中承受着持续的机械负荷，缺损部位难以在动态应力下实现稳定愈合。尽管已有如Barricaid?之类的机械性封堵装置问世，但它们仅提供物理屏障，缺乏生物活性，无法与宿主组织整合，并有装置移位等并发症报道。因此，开发能够同时调控免疫微环境、促进细胞再生并提供机械支撑的先进生物材料，成为解决这一难题的关键。
在此背景下，潘华军、梁成智、丁水华等研究人员在《Materials Today Bio》上发表了一项创新性研究，他们开发了一种超声响应的压电水凝胶支架（CPS gel），旨在通过一种协同策略来攻克纤维环修复的难题。这种水凝胶由三种功能模块巧妙整合而成：催化模块（二氧化铈CeO2纳米酶）、压电模块（聚-L-乳酸PLLA纤维）和机械模块（海藻酸钠SA水凝胶）。研究团队设想，该支架能在超声刺激下，同步实现免疫微环境的重编程、内源性细胞的定向募集以及机械功能的恢复，从而为纤维环的结构性再生提供一种全新的、有前景的解决方案。
为开展此项研究，研究人员运用了几个关键技术方法：通过溶剂热法合成具有类超氧化物歧化酶（SOD）和类过氧化氢酶（CAT）活性的CeO2纳米酶；采用静电纺丝结合退火工艺制备具有高β晶相含量、压电性能增强的PLLA纤维；利用海藻酸钠与钙离子的“蛋盒”模型构建可注射水凝胶，并通过GDL（D-葡萄糖酸-δ-内酯）辅助缓慢释放Ca2+形成均一稳定的三维网络。研究使用了原代人纤维环细胞（AFCs）和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW 264.7）进行体外功能验证，并建立了大鼠尾椎纤维环针刺缺损模型进行体内疗效和生物安全性评估。
3.1. CPS hydrogel preparation and characterization
研究人员首先成功制备了CPS水凝胶。表征结果显示，水热法合成的CeO2纳米颗粒呈八面体形态，X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）证实其具有立方萤石结构及Ce3+/Ce4+可变价态，溶解氧测定和SOD活性实验验证了其优异的类CAT和类SOD酶活性。静电纺丝结合退火处理的PLLA纤维排列均匀，XRD和差示扫描量热法（DSC）显示其具有高β晶相含量和约80%的结晶度，这有利于压电性能的提升。将CeO2和PLLA纤维整合入SA水凝胶网络后，扫描电子显微镜（SEM）显示其具有均匀的多孔结构，PLLA纤维呈现优先取向排列。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证实了各组分的成功复合。流变学测试表明水凝胶具有良好的机械性能和快速自恢复能力。压电力显微镜（PFM）和COMSOL模拟证实了材料在超声刺激下可产生压电效应，其中含5 mg/mL PLLA的CPS凝胶在40 kHz、0.33 W/cm2超声下输出最高电压达39.81 ± 7.01 mV，内部电场约12.9 mV/mm，处于已知可促进细胞迁移和增殖的范围内。
3.2. Assessment of CPS hydrogel biosafety and ROS scavenging capacity
生物安全性评估是临床应用的前提。CCK-8法和活/死细胞染色表明CPS水凝胶与AFCs和RAW 264.7细胞共培养时，细胞活力均超过90%，溶血率低于5%，证明了其良好的生物相容性。在模拟纤维环损伤后氧化应激的模型中，使用H2O2处理细胞，流式细胞术检测细胞内ROS水平显示，阳性对照组ROS水平显著升高，而含CeO2的CS凝胶和CPS凝胶能有效降低ROS水平。特别值得注意的是，CPS凝胶联合超声（US）处理能使ROS表达降低约57.6%，表明其能有效恢复氧化还原稳态。线粒体膜电位（ΔΨm）检测（JC-1染色）进一步发现，氧化应激会显著降低AFCs的ΔΨm，而CPS凝胶+US处理可将其恢复46.5%，说明该材料能维持病理条件下细胞的线粒体功能。
3.3. Assessment of the anti-inflammatory capacity of CPS hydrogel
纤维环损伤后的持续炎症微环境是修复的主要障碍。研究用脂多糖（LPS）诱导RAW 264.7细胞炎症模型，评估水凝胶的抗炎能力。免疫荧光和蛋白质印迹（Western Blot, WB）分析显示，LPS诱导显著提高了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的表达。与阳性对照+US组相比，CPS凝胶+US处理能分别抑制TNF-α和IL-1β表达达59.2%和68.1%，表明该支架能有效抑制NF-κB信号通路，驱动巨噬细胞向抗炎的M2表型极化，改善免疫微环境。
3.4. Evaluation of CPS hydrogel for ECM repair
细胞外基质（ECM）的修复是功能再生的基础。研究通过EdU染色、细胞划痕实验以及Col-1和AGG（Aggrecan）的免疫荧光和WB检测评估了CPS凝胶对AFCs功能的影响。结果发现，在炎症环境下，AFCs的增殖和迁移能力以及Col-1和AGG的合成均受到显著抑制。CPS凝胶能部分逆转这种抑制，而CPS凝胶+US处理则能进一步促进细胞增殖、迁移和ECM合成，其效果优于单独使用CPS凝胶，这归因于超声激活的压电效应。
3.5. RNA sequencing analysis of potential mechanisms by which CPS hydrogel promotes functional recovery of AFCs
为了深入揭示作用机制，研究人员对经LPS诱导的AFCs在CPS凝胶+US处理前后进行了RNA测序（RNA-seq）分析。转录组分析显示，处理后炎症相关基因（如TNFAIP3, NFKB1B, IL1A, TLR4）表达下调，而ECM结构基因（如ITGB4, COL8A1, COL4A1, AGRN）和钙通道相关基因（如CAVIN2, CAMKK1）表达上调。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，差异表达基因显著富集于ECM组织、钙离子转运、整合素结合以及TGF-β和PI3K-AKT信号通路上调，而NF-κB和TNF通路下调。基因集富集分析（GSEA）进一步验证了NF-κB通路活性降低，以及钙离子跨膜转运、PI3K-Akt信号通路和ECM-受体相互作用的激活。WB和qPCR验证了TLR4/NF-κB炎症通路被抑制（TLR4, IKKα, IκBα蛋白表达下降），而ITGβ1/PI3K/AKT/ERK通路被激活（ITGβ1, PI3K, Akt, ERK蛋白表达上升）。钙离子荧光成像（Rhod-2AM）也证实超声刺激能显著增加细胞内钙离子浓度。这些结果从分子层面阐明了CPS凝胶通过抑制TLR4/NF-κB通路改善炎症微环境，并通过激活ITGβ1/PI3K/AKT/ERK通路和钙信号促进细胞迁移、增殖和ECM合成的协同机制。
3.6. In vivo studies of CPS hydrogel for AF repair
最后，研究在大鼠尾椎纤维环针刺缺损模型中验证了CPS凝胶的体内修复效果。通过X射线、磁共振成像（MRI）、组织学染色（H&E, S&O）和免疫组织化学（IHC）以及生物力学测试进行综合评价。结果显示，与模型组（PC）相比，CPS凝胶+US治疗能显著改善椎间盘高度指数（DHI），降低Pfirrmann分级，表明椎间盘退变得到延缓。组织学观察发现，CPS凝胶+US组纤维环结构更完整，胶原排列更有序。IHC显示该组Col-1和AGG表达显著恢复，同时IL-1β和TNF-α表达明显降低。生物力学测试证实，CPS凝胶+US处理能有效恢复椎间盘的压缩模量和抗剪切疲劳性能。在治疗8周后，对主要器官的组织学检查和血液学分析未发现明显毒性反应，证明了该材料的良好生物安全性。
Conclusions
本研究成功开发了一种多功能超声响应压电水凝胶支架（CPS gel），通过协同整合催化（CeO2）、压电（PLLA）和机械（SA）三大功能模块，系统解决了纤维环修复中的三大瓶颈问题。CeO2通过其类酶催化活性有效清除ROS，抑制TLR4/IKKα/IκBα/NF-κB通路，驱动巨噬细胞向M2表型极化，重编程免疫微环境。超声激活的PLLA压电效应通过激活ITGβ1/PI3K/AKT/ERK信号轴和钙离子信号，促进AFCs的迁移、增殖和ECM合成。SA水凝胶则提供了与生理匹配的机械支撑和可控的降解性能。体内实验证实，该策略能显著促进纤维环的结构再生和功能恢复，恢复胶原沉积和椎间盘的机械性能。这项研究创新性地提出了通过按需超声激活来协调免疫调控、细胞行为引导和力学重建的协同修复策略，为纤维环的结构性再生提供了突破性的解决方案，在组织工程和再生医学领域具有重要的理论和应用价值。
