蟾毒灵负载光疗Janus膜通过即时杀伤与长期免疫抑制结直肠癌术后复发转移

《Materials Today Bio》：Immediate tumor killing and long-term anti-tumor immunoreaction induced by Bufalin-loaded phototherapeutic Janus membrane in CRC postoperative therapy

本研究针对结直肠癌术后高复发转移难题，开发了一种负载蟾毒灵的光热/光动力双功能Janus膜。通过构建具有组织黏附性的Janus结构，实现了局部缓释蟾毒灵与空间限域光疗的协同，有效诱导免疫原性细胞死亡并下调HSPs/HIF-1α/PD-L1通路，在小鼠模型中显著抑制原位复发和远端转移，为中医药现代化和术后联合治疗提供了新策略。

　　

结直肠癌是全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤，手术切除联合放化疗是早期患者的主要治疗方式。然而，由于早期症状隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，传统治疗方法面临多重耐药、放射抵抗以及高复发转移率的严峻挑战。尤其术后残留的微小病灶容易引发局部复发和远处转移，成为临床治疗的难点。系统性化疗虽然能一定程度控制病情，但常伴随全身毒性反应和耐药性问题，严重影响患者生活质量。因此，开发能够整合即时治疗效果与长期抗肿瘤免疫的新型术后治疗策略迫在眉睫。

传统中药因其多通道、多靶点的作用特点，在抗肿瘤药物研发中展现出独特优势。蟾毒灵（Bufalin, BU）作为蟾酥的主要活性成分，可通过诱导肿瘤细胞凋亡、坏死、自噬等多种死亡方式抑制肿瘤增殖，并能削弱肿瘤干细胞特性，抑制迁移侵袭和血管生成。然而，游离蟾毒灵存在水溶性差、半衰期短和系统毒性大等缺陷，限制了其临床应用。与此同时，光疗技术（包括光热疗法PTT和光动力疗法PDT）因其局部作用、副作用小等特点受到关注。两者均可诱导免疫原性细胞死亡（ICD），激活适应性抗肿瘤免疫应答。但单一光疗存在局限性：PTT诱导的热休克蛋白（HSPs）上调导致热抵抗，PDT则受肿瘤缺氧微环境制约。将PTT与PDT联合应用可产生协同效应：PTT改善肿瘤血流灌注缓解缺氧，增强PDT效果；PDT产生的活性氧（ROS）破坏HSPs的热保护机制，提高PTT敏感性。

针对上述问题，上海中医药大学附属普陀医院的研究团队在《Materials Today Bio》上发表研究，开发了一种负载蟾毒灵的光疗Janus膜系统。该研究通过将蟾毒灵负载于透明质酸修饰的柠檬酸碳点（BU-CDs_CA-HA），并整合至Janus结构膜中，构建了一个局部联合治疗平台。该设计能够牢固黏附于术后肿瘤部位，实现持续局部药物释放和空间限域的光疗，同时有效保护邻近健康组织免受热损伤。

研究采用的主要技术方法包括：通过水热法合成透明质酸修饰的碳点（CDs_CA-HA），利用β-环糊精包合技术负载蟾毒灵；通过界面聚合法构建具有双层结构的Janus膜；通过动态光散射、透射电镜、核磁共振等技术表征材料性质；建立小鼠原位和转移性结直肠癌模型评估治疗效果；采用流式细胞术、Western blot、免疫荧光等技术分析免疫应答机制。

3.1. BU-CDs_CA-HA的制备与表征

研究人员首先通过CA和HA的水热反应合成了CDs_CA-HA，然后利用β-环糊精对其进行修饰，成功制备了BU-CDs_CA-HA。表征结果显示，该碳点具有均匀的球形结构，粒径分布均一，药物负载量达到8.4%，包封率为91.2%。光热性能测试表明，BU-CDs_CA-HA在808 nm近红外光照射下表现出浓度和时间依赖的光热效应，且具有良好的光热稳定性。同时，该材料还能在光照下产生单线态氧，显示出双模光疗潜力。

3.2. Janus膜的制备与表征

通过界面聚合法成功构建了具有双层结构的Janus膜。其中PEG层呈白色半透明，黏附层因含有BU-CDs_CA-HA而呈棕色。扫描电镜显示两层界面结合紧密无分层。药物释放实验表明，Janus膜能有效减缓蟾毒灵的突释现象，实现持续可控释放。体内降解实验显示该膜在5周内可完全降解，且不会引起明显的组织炎症反应。

3.3. 体外抗肿瘤活性

细胞实验证实BU-CDs_CA-HA具有良好的生物相容性和血液相容性。凭借HA与肿瘤细胞表面CD44受体的特异性结合，BU-CDs_CA-HA能够有效被CT26和HCT116细胞摄取。在近红外光照射下，BU-CDs_CA-HA通过BU-PTT/PDT协同作用显著促进肿瘤细胞凋亡，存活率降至10.9%。Western blot分析显示，该处理能显著下调HSP70、HSP90、HIF-1α和PD-L1的表达水平。

3.4. 体外免疫应答

研究发现BU-CDs_CA-HA在近红外光照射下能有效诱导ICD，表现为钙网蛋白（CRT）膜转移、ATP释放和HMGB1分泌增加。这些损伤相关分子模式（DAMPs）能促进树突状细胞（DCs）成熟，成熟度达到82.0%，显著高于对照组。

3.5. 体内抗肿瘤效率

在皮下结直肠癌模型中，Janus膜能牢固黏附于肿瘤部位，在近红外光照射下使局部温度维持在48°C。治疗结果显示，BU-CDs_CA-HA+NIR组肿瘤生长受到显著抑制，大部分肿瘤组织基本消失。免疫分析表明，该处理能促进DCs成熟，增加CD4⁺/CD8⁺T细胞浸润，提高NK细胞活性，同时降低髓源性抑制细胞（MDSCs）比例，改善免疫抑制微环境。细胞因子检测显示IFN-γ、TNF-α和IL-6水平显著上调。

在双侧肿瘤模型中，Janus膜+NIR组不仅有效抑制原位肿瘤生长，对侧转移瘤也受到明显抑制，证明其能激活系统性抗肿瘤免疫应答。重要的是，Janus膜的PEG层能有效隔绝热量，保护周围组织免受烫伤。

研究结论表明，BU-CDs_CA-HA负载的Janus膜通过BU-PTT/PDT协同作用，实现了即时肿瘤杀伤与长期抗肿瘤免疫的有效结合。该策略不仅能通过热疗、ROS和药物直接杀伤肿瘤细胞，还能通过诱导ICD激活免疫应答，同时通过下调HSPs/HIF-1α/PD-L1通路克服治疗抵抗和免疫逃逸。这种"攻防一体"的治疗策略为结直肠癌术后治疗提供了新思路，也为中医药的现代化应用开辟了新途径。

该研究的创新之处在于成功将传统中药活性成分与先进材料技术相结合，构建了一个多功能治疗平台。不仅解决了蟾毒灵临床应用的技术瓶颈，还通过巧妙的材料设计实现了局部联合治疗的精准调控。研究成果为术后肿瘤治疗提供了新的技术选择，具有重要的临床转化价值。