《Journal of Integrative Plant Biology》：Enhanced exonuclease–Cas9 systems promote multiple nucleotide deletions with higher efficiency and broader targeting scope in plants
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该研究构建“外切酶-DBD-Cas9”融合平台（MND-Cas9v2），在保持编辑效率同时，将水稻缺失片段从1–2 bp拓展至6–18 bp，并兼容NGN PAM，实现miRNA（OsMIR530）与3′UTR（OsGhd2）大片段缺失，显著增大籽粒，为植物非编码区功能解析与精准育种提供通用工具。
研究背景
传统CRISPR-Cas9在植物中主要产生1–2 bp的小插入缺失（indels），难以破坏miRNA茎环、启动子顺式元件或UTR中的结构序列，限制了对非编码区功能的深度解析。为此，作者提出“让Cas9切得更大”的思路，借助外切酶（exonuclease）持续啃食3′末端，诱导更大范围的缺失。
MND-Cas9v1诞生
团队首先把四种外切酶——RecJ（5′→3′）、T5（5′→3′）、SbcB（3′→5′）、TREX2（3′→5′）——分别融合到SpCas9的N端，发现只有3′→5′方向的SbcB和TREX2能把缺失峰值从1–2 bp推到6–12 bp，且编辑效率与野生型Cas9持平，由此确立第一代“多重核苷酸缺失Cas9”（MND-Cas9v1）。
DBD“胶水”升级v2
受碱基编辑器中DNA结合域（DBD）可延长单链DNA暴露时间的启发，作者在SbcB/TREX2与Cas9之间插入DBD模块，构建SbcB-DBD-Cas9与TREX2-DBD-Cas9。水稻原生质体验证显示，v2版本同时提升编辑效率与缺失长度：缺失分布拓展至5–18 bp，效率最高提升2.3倍，实现“切得大且切得快”。
PAM松绑——NGN时代
为摆脱NGG PAM限制，作者把v2架构嫁接到Cas9-NG（NGN PAM）与SpG（NGN PAM）骨架，获得MND-Cas9-NG/SpG v2。八个水稻内源位点测试表明，TREX2-DBD-Cas9-NG在NGA、NGC、NGT、NGG四类PAM均保持高效率，缺失范围同样拓宽至5–15 bp，理论可靶向基因组位点增加4倍。
实战一：敲除miRNA让籽粒“长胖”
OsMIR530通过抑制靶基因OsPL3负向调控籽粒大小。常规Cas9仅能产生3 bp内小突变，难以破坏miRNA前体茎环。作者用MND-Cas9v2单次导向，获得7–19 bp缺失的三种纯合突变体。RNA二级结构预测显示突变体茎环完全解体，成熟miRNA无法加工；qRT-PCR显示OsPL3表达上调2.5–3.1倍，籽粒长度、宽度均显著增加，而株高与分蘖数不变，证明“切大片段”策略可精准敲除miRNA且不扰动整体发育。
实战二：删掉UTR“刹车”元件解除翻译抑制
OsGhd2的3′UTR含一个SMITE（小反向重复转座子）茎环，可抑制翻译。作者设计双sgRNA完全删除SMITE（m01）或单sgRNA部分破坏茎环（m02、m03），获得缺失12–28 bp的突变体。表型上籽粒显著增大，但mRNA水平无变化；双荧光报告实验（ZsGreen/mCherry）显示，突变3′UTR的翻译效率提高1.6–1.9倍，直接证实SMITE通过结构而非转录水平抑制翻译，也展示MND-Cas9v2在调控元件精细解剖中的威力。
安全性评估
在可观察范围内，最大缺失仅42 bp（原生质体）与28 bp（稳定系），未出现kb级大片段丢失，提示外切酶融合并未诱导极端删除；脱靶风险与Cas9-NG/SpG本体相当，需后续全基因组测序确认。
未来展望
MND-Cas9v2系统已覆盖NGG与NGN PAM，理论上可拓展至SpRY（NRNH PAM）或Cas12a（TTV PAM）骨架，实现“全PAM覆盖”。其高效缺失特性亦适用于启动子区域多转录因子结合位点的一次性切除、长链非编码RNA（lncRNA）模块删除及合成生物学中的精细底盘构建。随着平台载体已向Addgene提交，全球植物育种实验室可快速复现并二次开发，为下一代“非编码区驱动的智能育种”提供通用手术刀。
