大肠杆菌LetAB复合体结构揭示新型跨膜转运蛋白家族与脂质运输新机制

《Nature》：LetA defines a structurally distinct transporter family

这篇研究报道了大肠杆菌LetAB磷脂转运复合体的冷冻电镜结构，发现LetA采用与已知转运蛋白家族无关的独特结构，其跨膜结构域与真核生物四跨膜超家族进化相关。研究通过深度突变扫描、分子动力学模拟和功能实验，揭示了LetA通过构象变化驱动磷脂从内膜转运至LetB隧道的新机制，为细菌膜脂质稳态维持提供了重要见解。

　　

LetA定义了一个结构独特的转运蛋白家族

膜转运蛋白在细胞膜上转运各种货物，从小的糖分子到整个蛋白质。目前已知少数结构不同的蛋白质家族负责大多数膜转运过程，但许多预测具有转运功能的膜蛋白仍未被表征。本研究确定了大肠杆菌LetAB的结构，这是一种参与外膜完整性的磷脂转运蛋白，发现LetA采用了一种独特的结构，在结构和进化上与已知转运蛋白家族无关。

LetA定位于内膜，负责将脂质装载到其结合伴侣LetB中。LetB是一种哺乳动物细胞进入（MCE）蛋白，形成一个约225 ?长的隧道，用于脂质跨细胞包膜运输。出乎意料的是，LetA的跨膜结构域采用了一种在进化上与真核生物四跨膜超家族相关的折叠，包括跨膜AMPA受体调节蛋白（TARP）和闭合蛋白。通过深度突变扫描、分子动力学模拟、AlphaFold预测的替代状态和功能研究，我们提出了一个模型，解释LetA样膜转运蛋白家族如何促进脂质跨细菌细胞包膜的运输。

LetA和LetB形成复合体

删除letA和letB会导致对胆汁盐胆酸盐和两性离子表面活性剂月桂基磺基甜菜碱（LSB）的敏感性。缺乏letA或letB的菌株表现出相似的生长缺陷，这可以通过携带野生型letAB的质粒来挽救。免疫共沉淀实验表明，His标记的LetA可以下拉LetB，形成约670 kDa的复合物。负染电子显微镜显示LetAB颗粒具有七个特征性的密度带，类似于LetB，并且在一端有额外的球状密度，推测对应于LetA和LetB的跨膜螺旋。

LetA促进脂质装载到LetB中

先前研究表明，LetB的可溶性周质结构域结合磷脂，交联实验表明结合位点位于LetB中央隧道内。为了研究磷脂是否自发进入完整膜嵌入的LetAB复合物的隧道，研究人员使用了体内交联实验。在LetB隧道内部位点引入光交联非天然氨基酸p-苯甲酰-l-苯丙氨酸（BPA），并在活细胞中进行UV照射交联。结果显示，隧道内的四个BPA位点均检测到³²P掺入，而隧道外的位点则几乎没有。重要的是，隧道内有效的交联依赖于LetA的共表达，而LetB的膜定位不受LetA共表达的影响。这些结果表明，LetA是体内全长LetB隧道中磷脂进入所必需的。

LetAB复合体的整体结构

通过冷冻电镜确定了LetAB复合体的结构。该复合体是一个细长的组装体（长约290 ?，宽约90 ?），由六个LetB拷贝和一个LetA拷贝组成，其中LetB占总长度约225 ?。每个LetB拷贝包含七个MCE结构域，与其他LetB原体横向关联，形成七个MCE环，创建一个疏水隧道。六个N端跨膜螺旋，每个来自一个LetB原体，将组装体锚定在内膜中。一个LetA拷贝与MCE环1和LetB的跨膜螺旋相互作用。LetA周缘约30 ?的疏水带定义了可能嵌入内膜的区域。电子密度图中仅可见六个LetB跨膜螺旋中的四个，这四个已解析的螺旋以两种非等效方式与LetA相互作用。

LetB中央隧道的壁由每个MCE结构域突出的孔衬环形成。先前删除跨膜螺旋的LetB冷冻电镜结构表明，MCE环1、5、6和7的孔衬环可以采取开放和闭合构象，控制中央隧道的直径，从而可能调节底物的通过。在没有LetA的情况下，LetB的MCE环1主要处于闭合状态，孔不够宽，无法允许磷脂通过。而在LetAB结构中，LetB的MCE环1采取开放状态，表明与LetA的结合调节了LetB隧道的构象。

LetA的整体结构

大肠杆菌LetA是一个单一多肽，由两个相关的模块组成，称为“LetA模块”。每个LetA模块包括一个胞质锌带（ZnR）结构域，后跟一个跨膜结构域（TMD）。这些模块在变形菌门中广泛存在，既可以存在于编码两个LetA模块的单个基因中，也可以存在于两个相邻的基因中，每个基因编码一个LetA模块。大肠杆菌LetA当两个LetA模块被人工拆分成单独的基因时，可以形成功能性异源二聚体。

每个LetA模块的TMD包含四个跨膜螺旋，一个位于膜-周质界面的界面螺旋，以及一个延伸至周质的三链β-片层。两个LetA模块以头对头的方式关联，形成具有二重伪对称性的分子内二聚体。两个TMD形成倒V形，产生一个大的、面向胞质的亲水裂隙。在这个裂隙中，观察到一个³⁶¹GRWSM-Ψ-D-Ψ-F³⁶⁹基序，该基序在C端LetA模块中在不同LetA样蛋白中高度保守。此外，LetA含有一个体积为174 ?³的周质口袋，该口袋是两亲性的，主要由TMD^C的残基以及TMD^N的TM3形成。这个周质口袋直接位于LetB隧道入口的下方，LetA的周质β-片层创建了一个疏水桥，连接口袋与LetB MCE环1的孔衬环。

在胞质侧，ZnR^N和ZnR^C相互作用形成一个结构单元。每个ZnR结构域由两个堆叠的β-发夹组成，具有一个参与金属结合的四半胱氨酸 motif。ZnR^C连接TMD^N和TMD^C，并与ZnR^N非共价相互作用形成ZnR二聚体，可能稳定LetA N端和C端部分的关联。电感耦合等离子体质谱分析显示，LetA特异性富集锌原子，校准表明每个LetA分子结合约两个锌原子，表明两个ZnR结构域在实验条件下优先配位锌。

LetA定义了一个新的转运蛋白家族

为了评估LetA是否与已知转运蛋白家族进化相关，研究人员使用Foldseek在蛋白质数据库（PDB）中进行了基于结构的搜索。未能识别出与已知转运蛋白折叠的结构相似性，表明LetA代表了一种新型的膜转运蛋白。然而，该搜索揭示单个LetA TMD在结构上与真核生物的四跨膜超家族整合膜蛋白相关。LetA TMD与TARP和闭合蛋白最相似，它们的胞外区域具有结构等效的β-片层，并与VKOR和四跨膜蛋白本身关系较远。所有这些蛋白质在跨膜螺旋中共享一个共同的拓扑结构，但只有LetA包含ZnR结构域，并排列为具有两个连续四跨膜样结构域的伪二聚体。

为了探索LetA与尚未实验表征蛋白质的进化关系，对AlphaFold预测蛋白质结构数据库进行了Foldseek搜索。除了细菌LetA样蛋白外，该搜索揭示了在一些寄生虫和海洋原生生物中存在潜在未表征的全长LetA结构同源物。这些AlphaFold预测类似于LetA，但缺乏ZnR结构域。由于MCE蛋白通常仅限于双膜细菌和光合真核生物，目前尚不清楚LetA样蛋白如何在寄生虫和海洋原生生物中发挥作用。这些分析将LetA和LetA样蛋白置于四跨膜超家族中，该家族先前被认为是真核生物的创新，但本研究显示也存在于原核生物中。

LetA的深度突变扫描

为了无偏倚地了解LetA中功能重要的残基，研究人员使用了深度突变扫描，其中LetA中的每个位置被突变为所有可能的氨基酸。评估了每个突变在存在LSB或胆酸盐的情况下对LetA功能的影响。热图显示，胆酸盐和LSB的突变效应模式相似。对于每个位置，计算了耐受性评分，范围从0到1，其中0表示不容忍突变，1表示完全容忍。约90%的残基耐受突变，包括LetA N端约25个残基的胞质延伸。然而，LetA中一部分位置的突变耐受性较低，包括胆酸盐的53个位置和LSB的37个位置。这些功能重要的残基大多数聚集在LetA结构的三个区域：TMD^C中的周质口袋、TMD^C中的极性网络和ZnR结构域。

周质口袋位于LetB隧道正下方，非常适合作为脂质在内膜和LetB之间移动的结合位点，类似于在四跨膜蛋白和VKOR中观察到的脂质结合位点。从胆酸盐和LSB数据集合并来看，约一半所有低耐受性评分的位置聚集到该区域，表明周质口袋功能重要。这些残基大多数是疏水的，并且较不容忍突变为极性残基，表明维持该口袋的疏水特性至关重要，这与结合脂质或其他疏水分子的作用一致。

一个具有低耐受性评分的保守残基簇形成了一个跨膜的极性网络，从周质口袋到细胞质。这些残基位于TMD^C的核心，具有极性或带电侧链，这在跨膜区域是不寻常的。其中两个残基属于LetA中央裂隙附近的³⁶¹GRWSM-Ψ-D-Ψ-F³⁶⁹基序，该基序中的其他残基也对突变中度敏感。将这些极性网络残基中的每一个突变为丙氨酸对LetA表达或LetB结合影响很小，表明极性网络在转运机制中具有特定作用，独立于折叠或稳定性。平衡分子动力学模拟显示，水存在于TMD^C核心内，与极性残基形成氢键相互作用网络，桥接周质和胞质空间。因此，这个保守的极性网络可能与水相互作用，并且可能对底物相互作用或作为能量来源的质子穿梭很重要。

ZnR结构域通常由金属配位半胱氨酸稳定。正如预期，LetA ZnRs中金属配位半胱氨酸的突变不被容忍，并导致LetA蛋白水平降低。除了Cys残基外，LetA ZnR结构域中没有其他残基对突变敏感，表明LetA ZnRs不太可能介导蛋白质-蛋白质相互作用，相反，整体ZnR折叠可能有助于LetA的稳定性。将LetA的ZnR^N和ZnR^C替换为大肠杆菌PqiA的ZnR结构域，它们分别共享41%和28%的序列同一性，该ZnR交换突变体显示出与野生型相似的胆酸盐和LSB抗性，表明在Zn配位半胱氨酸之外可以容忍显著的序列差异。为了检查ZnR是否对功能至关重要，测试了两个ZnR缺失突变体的互补实验。LetAΔZnR^N未能挽救生长并且无法下拉LetB，表明该突变干扰了折叠。LetAΔZnR^C尽管表达水平较野生型降低，但部分挽救了生长，并在下拉实验中与LetB结合。这些结果表明LetAΔZnR^C蛋白是折叠的并且至少部分功能正常。一些LetA同源物完全缺乏ZnR^C。这些结果导致了一个模型，其中锌结合是稳定ZnR折叠所必需的，并且ZnR结构域可能在调节结构或变构调节脂质转运中起作用。

脂质结合和特异性

在LetA的中央裂隙中，明显的额外密度与二酰基脂质的大小和形状一致，称为“脂质1”。脂质1的密度在未交联图中比交联图中解析得更好。位点特异性交联表明，脂质1位点在体内也被磷脂占据，分子动力学模拟显示脂质保持稳定地结合在该位点。然而，与该脂质接触的LetA残基在DMS数据中通常对突变不敏感。这些发现表明脂质1稳定地结合于LetA，但可能不代表底物。

在分子动力学模拟中，观察到脂质自发向上运动进入中央裂隙，该位点位于脂质1位点的对面。该脂质的身份在不同重复中不同，其位置在重复之间略有不同。脂质2起源于内膜的胞质小叶，并沿着裂隙移动到膜中大约一半的位置，朝向周质口袋，在那里保持稳定结合。假设脂质2代表底物，并提出了一个转运机制，涉及（1）脂质从胞质小叶自发移动到膜中部，（2）可能随着LetA的构象变化易位到周质口袋，以及（3）从LetA周质口袋转移到LetB隧道。为了探索脂质2从中央裂隙到周质口袋的可能轨迹，进行了牵引分子动力学模拟。为了适应脂质2从裂隙到口袋的运动，IF^C和TM2a^C螺旋作为一个单元横向打开，类似于一个瓣，揭示了一个两亲性沟槽。牵引一条尾部所需的工作量最少，导致尾部张开，被疏水残基屏蔽，而头部基团位于口袋内部，与极性网络的残基K178、D181和D367相互作用。

为了观察脂质2如何松弛进入周质口袋，从每个SMD模拟达到的最终状态开始进行了300纳秒平衡模拟。发现脂质2采样一组构型，并观察到两个共同主题：首先，脂质的带负电磷酸头部基团与来自LetB环1的R63相互作用，该残基面向LetA的周质口袋。LetB R63在LetB样蛋白中保守为Arg或Lys，并且对LetAB功能重要，因为突变为其他氨基酸会导致对胆酸盐和LSB的敏感性，尽管表达水平相似。其次，脂肪酰基尾部以不同方向采样LetA周围的疏水表面，包括两个尾部都向下朝向周质口袋，向上朝向LetB的孔，或处于张开构型。脂质2和LetAB之间的相互作用让人联想到大肠杆菌MlaFEDB冷冻电镜结构中描述的蛋白质-脂质相互作用。其中一个结合的磷脂采用张开构型，头部基团与附近的Arg残基对接，类似于LetB R63。在脂质从MCE亚基转移到ABC转运蛋白期间可能发生类似过程。分子动力学模拟不涉及底物的脂质特异性，通过脂质组学实验探索LetAB是否具有脂质偏好。发现磷脂酰乙醇胺（PE）在纯化的LetAB中富集，心磷脂耗尽，而磷脂酰甘油（PG）水平没有显著差异。这种偏好是反映了LetA底物特异性还是结合在TMDs外围的膜脂质尚不清楚。

LetA的构象变化

为了探索LetA潜在的替代构象，使用了基于AlphaFold2的方法。生成了160个预测，根据LetA TMDs的状态可以分为五个主要簇。簇1中的模型与冷冻电镜结构相似。在其余四个簇中，观察到两种主要类型的潜在运动，它们以不同程度和不同组合发生。首先，TMD^C相对于TMD^N旋转，最高约45°，围绕大致垂直于膜平面的轴。其次，在簇4和5中，一个TM3片段在TMDs界面处滑过另一个。TMD旋转和TM3滑动运动的结合导致两个TM3螺旋和由IF^C和TM2a^C螺旋形成的瓣之间打开一个两亲性沟槽，该沟槽将分子动力学模拟中中央裂隙的脂质2位点连接到周质口袋。该沟槽由对突变敏感的极性和疏水残基组成。这个预测的状态表明了一个与SMD模拟一致的脂质运动的可能路径。

为了评估LetA是否在体内采样预测的替代状态，重点关注了模型149，它代表了相对于冷冻电镜结构的一些最大构象变化。设计了一个基于半胱氨酸的体内交联实验，在LetA中引入了成对的半胱氨酸突变，这些位置对之间半胱氨酸的距离预计在冷冻电镜状态和模型149之间会发生变化。在交联剂存在下，预计突变会在模型149或冷冻电镜结构中选择性交联，但不会同时在两者中发生。野生型LetA含有11个半胱氨酸，其中3个是非必需的，8个在ZnR结构域中配位金属以促进蛋白质折叠。使用这三个非必需半胱氨酸突变为丝氨酸的分割LetA构建体作为这些突变的背景。BMOE处理L94C/I383C和Q180C/R380C双突变体导致二聚体条带相对于DMSO对照分别增加约六倍和五倍，表明冷冻电镜和模型149状态在细胞中被采样。单突变对照表现出背景水平的交联，表明双突变体中的交联是特异性的。这些结果支持存在一个与AlphaFold2预测一致的“开放沟槽”LetA状态，这可能促进转运。

讨论

LetB形成一个跨细菌细胞包膜的疏水隧道，使得脂质能够在内膜和外膜之间运输。脂质如何被装载到LetB中以前是未知的，并且推测LetA在脂质转运机制中起作用。提出了一个LetAB介导的脂质转运模型：（1）LetA与LetB结合促进LetB MCE环1孔的打开。在细胞中，尚不清楚LetA是否与LetB组成型结合。（2）LetA可能导致膜局部扭曲，使得磷脂能够从内膜的胞质小叶自发运动进入LetA中央裂隙。（3）为了易位脂质，LetA可能发生构象变化，揭示一个两亲性沟槽。LetA的构象变化由AlphaFold2预测，并与体内交联实验结果一致。（4）脂质以尾部张开的构象穿越两亲性沟槽，每个脂肪酰基尾部与功能重要的疏水残基相互作用。（5）脂质到达LetA周质口袋，在那里基本上是灵活的，但受到极性头部基团与LetB MCE环1的R63相互作用的约束。（6）脂质从周质口袋挤出，并滑过LetA的周质β1和β3链进入LetB隧道，然后LetA返回到静息状态。LetA转运蛋白是被动的还是与质子驱动力偶联尚不清楚。该模型暗示LetAB将磷脂从内膜输出到外膜，但需要未来的实验来明确确定转运蛋白的方向性。

所提出的机制类似于提取器，如脂多糖（LPS）输出蛋白，它通过LptFG二聚体的中央空腔从内膜的外小叶提取LPS。ATP依赖的构象变化导致中央口袋塌陷，并将LPS挤压到由LptC和LptA形成的跨周质桥中，以介导LPS转运到外膜。在三酰甘油提取系统Rv1410–LprG中也报道了类似的机制，其中Rv1410是定位于分枝杆菌内膜的主要协助超家族转运蛋白。三酰甘油结合到Rv141