《Protein Science》：Differences in Src phosphorylation of PSD-93 and PSD-95 drive differences in scaffolding activity
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本研究揭示了突触支架蛋白PSD-93和PSD-95虽具有高度保守的域结构，但在Src激酶介导的酪氨酸磷酸化上存在显著差异。PSD-93是更高效的磷酸化底物，其磷酸化位点多位于连接区和GuK域。磷酸化对二者与突触后客户蛋白（如GluN2B、nNOS、neuroligin、stargazin）的亲和力及三元复合物形成（支架活性）产生相反影响，并特异性地调控PSD-93（而非PSD-95）与GluN2B的生物分子缩聚。这些功能差异可能对应于突触成熟的不同阶段，为理解其在突触可塑性中的相反作用提供了分子机制新见解。
1 引言
支架蛋白通过其多个结合模块，能够在无需直接相互作用的情况下，使蛋白质共定位，从而形成高效的细胞功能单元。突触膜相关鸟苷酸激酶（MAGuK）家族支架蛋白是研究保守蛋白相互作用模块如何通过可变连接区产生新功能的典型例子。其中，突触后密度蛋白93（PSD-93）和突触后密度蛋白95（PSD-95）具有相同的域组织，即三个PDZ域、一个SH3域和一个GuK域，由无序连接区连接。尽管它们的折叠域高度保守，但PSD-93和PSD-95在突触可塑性中扮演着相反的角色，PSD-93促进突触增强，而PSD-95是突触抑制所必需的。Src家族蛋白酪氨酸激酶是突触可塑性诱导所必需的，但关于MAGuK作为激酶底物的直接功能影响尚不清楚。
2 结果
2.1 Src磷酸化位点的鉴定
通过体外磷酸化实验和质谱分析，研究发现PSD-93是比PSD-95更高效的Src底物。PSD-93最终每个分子可结合4.1个磷酸基团，而PSD-95仅为1.3个。磷酸化位点主要分布在连接区和GuK域。使用包含调控域的三结构域Src或仅含激酶域的结构域进行反应，揭示了磷酸化位点分布的相似性，但具体位点的占据率存在差异，表明Src的调控域可能影响底物特异性。
2.2 磷酸化对支架活性的影响
利用Bead Halo assay测量了磷酸化对MAGuK与突触后客户蛋白（包括NMDA受体亚基GRIN2B (GluN2B)的CTD2域、神经连接蛋白 (NL) 的CTD、神经元型一氧化氮合酶 (nNOS) 的PDZ域以及stargazin的CTD）的二元亲和力及三元复合物形成（支架活性）的影响。结果表明，磷酸化对PSD-93和PSD-95与不同客户蛋白的亲和力及支架活性产生了差异性的，甚至是相反的影响。例如，磷酸化增强了PSD-95对GluN2B和NL的支架活性，但降低了PSD-93对NL的支架活性。此外，PSD-93在磷酸化后对某些客户蛋白的组合抑制消失，而PSD-95的组合抑制效应则保持不变。
2.3 磷酸化对生物分子缩聚的影响
研究发现PSD-93和PSD-95均能与GluN2B发生生物分子缩聚。在相同条件下，PSD-93的缩聚分相率高于PSD-95。Src磷酸化增加了PSD-95的缩聚分相率，但显著降低了PSD-93的缩聚分相率以及与之共缩聚的GluN2B和nNOS的分相率，而对NL的分相率无影响。研究还发现NL和nNOS均可加入MAGuK-GluN2B二元缩聚物中，而synGAP的存在会排斥NL进入缩聚物。
2.4 磷酸化的结构效应
通过尺寸排阻色谱（SEC）和小角X射线散射（SEC-SAXS）分析发现，磷酸化导致PSD-93的流体力学半径（RH）和回转半径（Rg）轻微增加，表明其结构有所扩展，而PSD-95的结构则未受明显影响。归一化Kratky图和配对距离分布函数表明两种蛋白均具有柔性且存在内在无序区域。
2.5 单分子荧光共振能量转移 (smFRET)
利用smFRET技术探测了磷酸化对蛋白质局部构象和动力学的影响。结果显示，磷酸化主要影响了连接区的动力学（表现为FRET效率分布宽度的变化），而对PSG超模块（PDZ3-SH3-GuK）的超三级结构影响较小。PSD-93和PSD-95在多个位点的FRET分布宽度变化方向相反，进一步支持了磷酸化对二者动态特性产生差异性调控。
3 讨论
本研究系统比较了PSD-93和PSD-95作为Src激酶底物的特性及其磷酸化对功能的影响。尽管二者结构相似，但PSD-93是更高效的磷酸化底物。磷酸化对二者的客户蛋白亲和力、支架活性和生物分子缩聚产生了显著且不同的影响。PSD-95的支架活性在磷酸化后普遍增强，且其生物分子缩聚不受影响；而PSD-93的磷酸化则消除了部分组合抑制，但降低了其生物分子缩聚能力。这些功能差异可能与它们在突触可塑性的不同阶段发挥作用有关：PSD-95可能更适用于低蛋白浓度下的精细调控，而PSD-93可能在较高蛋白浓度下通过调节缩聚来发挥作用。Src磷酸化成为调控这两个高度相似支架蛋白功能分化的关键节点。研究还揭示了蛋白相互作用亲和力与相分离行为之间存在解耦现象。
