内源性荧光金属-有机框架比率荧光传感策略：结合CRISPR/Cas12a实现四环素的超灵敏检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Endogenous Fluorescent Metal-Organic Framework Ratio Fluorescence Sensing Strategy: Combining CRISPR/Cas12a for Ultra-Sensitive Detection of Tetracycline

比率荧光传感器基于CRISPR/Cas12a与PCN-224金属有机框架的协同作用，实现四环素高灵敏度检测（限8.7nM），兼具快速、高效及抗干扰优势，适用于食品与环境监测。

　　

林慧凯|杜彩仪|徐宁仪|王一茹|孙春燕

吉林大学食品科学与工程学院食品质量与安全系，长春130062，中国

摘要

CRISPR/Cas12a在结合单链DNA时可以激活切割活性，这使其在高度敏感的荧光生物传感器中得到广泛应用。利用单色荧光输出模式的传感器容易受到多种因素的干扰，导致检测方法不稳定。为了解决这个问题，我们设计了一种基于核酸适配体（42TET）和锆基金属有机框架（PCN-224）与CRISPR/Cas12a协同信号放大的比率荧光传感器来检测四环素（TCs）。PCN-224吸附单链DNA，淬灭其标记有FAM的荧光，同时发出自身的荧光信号。这种双荧光输出减少了背景干扰，提高了检测精度。通过设计一个作为核酸适配体互补序列（cDNA）的激活剂，该系统在四环素存在下与42TET结合，释放cDNA以激活CRISPR/Cas12a系统。通过这种系统的信号放大能力，实现了对四环素的高灵敏度检测，检测限达到8.7 nM。其检测能力与传统的高效液相色谱（HPLC）方法相当。该方法简单、快速、高效且定量性强，为未来的应用提供了广阔前景。

引言

抗生素的广泛使用保护了人类健康，但也带来了严重的环境残留问题[1]。其中，四环素（TCs）作为最常用的广谱抗生素之一，因其环境行为和生态风险而受到广泛关注[2]。环境中持续存在的TCs残留不仅会导致耐药菌株的出现[3]，还可能通过食物链中的生物积累威胁人类健康[4]。世界卫生组织（WHO）和国家监管机构已经为食品和环境中的TCs制定了严格的最大残留限量。欧盟将牛奶中四环素的最大残留限量设定为100 μg/L[5]。传统的TCs检测方法主要涉及高效液相色谱和液相色谱-质谱等仪器分析技术[6]。虽然这些方法准确可靠，但存在设备昂贵、样品制备复杂和检测周期长等缺点[7]，不适合快速现场检测[8]。因此，建立一种快速、准确且灵敏的TCs检测方法具有重要的实际意义[9]。为了克服上述方法的不足，我们利用适配体、CRISPR/Cas12a和卟啉基金属有机框架，实现了快速、准确和灵敏的四环素检测，为食品中抗生素的快速检测提供了一种新方法。

适配体（Apt）具有分子量低、化学稳定性好、易于合成和修饰[10]以及能够特异性[11]识别各种目标分子[12]等优点。作为监测系统中的目标物质识别元件，适配体在TCs检测中得到广泛应用[13]、[14]。规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas12）在构建传感平台中得到广泛应用[15]、[16]。其中，CRISPR/Cas12a依靠CRISPR RNA（crRNA）识别双链DNA（dsDNA）中的PAM序列，从而激活Cas12a核酸酶活性[17]。或者，crRNA与单链DNA之间的互补结合可以激活Cas12a蛋白的切割活性[18]。这些特性使其在研究中得到广泛应用。先前的研究广泛使用荧光信号进行TCs检测，因为它们具有高灵敏度和安全性优势[19]、[20]、[21]。然而，单模荧光信号输出容易受到复杂背景的干扰[22]。在操作过程中，人为错误、交叉污染和酶降解等问题可能会影响检测结果的准确性。比率荧光传感技术在光学检测中具有显著优势，因为它通过测量两个或多个发射信号的比例而不是单一强度值来实现内部自校准[23]。与传统单信号荧光技术相比，比率荧光传感器通常表现出更高的灵敏度和更强的抗背景干扰能力，从而能够更精确地量化生物、环境和化学系统中的分析物。双发射策略进一步拓宽了动态范围，实现了实时监测，同时减少了假阳性[24]。这些优势使比率荧光技术成为临床诊断、环境监测和即时检测等先进光学传感平台中的强大工具。因此，我们在系统中采用双荧光信号输出模式，显著减少了背景噪声和仪器引起的干扰[25]，从而进一步提高了检测系统的灵敏度和自校准能力[26]、[27]。

选择PCN-224作为MOF平台，是因为它独特地结合了MOF材料的结构优势与卟啉单元的固有光物理性质[28]、[29]。其高度有序的多孔框架和大比表面积使得生物分子（特别是单链DNA）通过π–π堆叠、静电相互作用和配位效应有效吸附[30]。重要的是，PCN-224表现出强而稳定的固有荧光，使其不仅可以作为纳米载体，还可以作为内部光学参考信号[31]、[32]。这种双重功能对于构建具有更高精度和抗环境波动能力的比率荧光系统至关重要[33]。此外，PCN-224优异的化学稳定性和生物相容性确保了其在食品和环境样品等复杂基质中的可靠性能，使其特别适合用于生物传感应用[34]。适配体因其对小分子抗生素的高亲和力和优异的特异性而受到广泛认可，使其成为荧光传感的有吸引力的识别元件。同时，CRISPR/Cas12a提供了可编程的激活和强大的切割活性，为超灵敏检测提供了强大的信号放大能力。为了进一步提高分析可靠性，将双功能金属有机框架PCN-224集成进来，引入了具有内在自校准能力的比率荧光读出。这种组合策略有效地补偿了探针浓度、激发强度和样品基质效应的变化，从而提高了信号的稳定性、准确性和鲁棒性。因此，Aptamer–CRISPR/Cas12a–PCN-224平台能够灵敏且可靠地检测小分子抗生素，并提高了分析性能。

在这项研究中，设计了一种基于比率的荧光传感器来检测TCs，该传感器由适配体和具有荧光特性的CRISPR/Cas12a及金属有机框架（MOF）复合材料组成（图1）。在对PCN-224吸附FAM标记的单链DNA（FAM-ssDNA）及其FAM荧光淬灭机制进行深入研究后，在用作目标识别元素的特定核酸适配体（42TET）的互补链（cDNA）中设计了CRISPR/Cas12a激活序列。在目标序列（TCs）存在下，42TET特异性结合，释放cDNA与crRNA互补结合。这激活了Cas12a的水解酶活性，使其切割FAM-ssDNA。因此，吸附在PCN-224上的FAM-ssDNA被切割，释放出碎片化的FAM-ssDNA到溶液中，恢复FAM荧光。在这个系统中，适配体确保了目标DNA的选择性识别，而释放的cDNA仅在目标存在下触发Cas12a的激活，从而保证了高特异性。Cas12a介导的FAM-ssDNA切割产生目标依赖的荧光恢复信号，而PCN-224的稳定荧光发射作为内部参考。与传统单模CRISPR或基于MOF的传感器相比，这种协同设计显著提高了分析可靠性和定量精度。值得注意的是，这项研究通过将CRISPR/Cas12a技术与卟啉金属有机框架结合，建立了基于比率的检测平台，用于小分子抗生素的检测，填补了研究空白。这一策略不仅扩展了CRISPR诊断的应用范围，还为开发适用于食品安全和环境监测的稳健生物传感器提供了通用框架。

试剂和材料

EnGen? Lba Cas12a (Cpf1) 和 NEBuffer? r2.1 来自 New England Biolabs（美国伊普斯威奇）。ZrOCl₂·8H₂O、苯甲酸（BA）、endo-四（4-羧基苯基）卟啉（H₂TCPP）、N, N-二甲基甲酰胺（DMF）、Tris-HCl 缓冲液、Pb²⁺ 标准溶液、Cu²⁺ 标准溶液、四环素、氯霉素、卡那霉素、链霉素、土霉素、环丙沙星、诺氟沙星、磺胺甲噁唑购自上海阿拉丁生化科技有限公司。NaCl、MgCl₂、KCl、CaCl₂、赖氨酸、甘氨酸等。

PCN-224纳米材料的表征

PCN-224通过简单的溶剂热方法合成，将锆离子和endo-四（4-羧基苯基）卟啉在DMF中混合（图1A，图S1）。扫描电子显微镜（SEM）显示PCN-224由表面有皱纹的均匀分散的球形晶体组成（图1B）。透射电子显微镜（TEM）图像进一步揭示了PCN-224的微观结构特征，确认其为表面粗糙的立方体球（图1C）[36]。

结论

总之，本研究展示了一种基于核酸适配体和PCN-224结合CRISPR/Cas12a信号放大的比率荧光传感器，用于超灵敏地检测四环素。系统研究了PCN-224对单链DNA（ssDNA）的吸附机制和FAM的淬灭机制。值得注意的是，ssDNA吸附和荧光淬灭的巧妙结合在材料性质和CRISPR信号放大之间建立了机械桥梁。

CRediT作者贡献声明

杜彩仪：撰写 – 审稿与编辑、方法学、数据分析。林慧凯：撰写 – 原始草稿、方法学、数据分析。王一茹：数据分析。徐宁仪：数据分析。孙春燕：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国吉林省自然科学基金（20230402024GH）、中国重庆市自然科学基金（CSTB2023NSCQ-MSX0895）、中国吉林省发展和改革委员会（2023C014）、中国吉林大学2025年研究生创新研究计划（2025CX198）的支持。

作者声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

林慧凯目前正在吉林大学食品科学与工程学院攻读博士学位。他的主要研究方向是食品中有害物质的快速检测。