《Sensors and Actuators B: Chemical》：A microfluidic fluorescence biosensor based on entropy-driven catalytic and G-triplex-mediated dual amplification for highly sensitive detection of HIV-1 p24
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高效集成微流控荧光平台实现HIV-1 p24高灵敏检测
邓志成|胡杰西卡|朱雪明|刘新怡|王一芳|范冰|高丹
清华大学深圳国际研究生院生物制药与健康工程学院，清华-深圳联合研究院，化学肿瘤基因组学国家重点实验室，化学生物学重点实验室，中国深圳518055
摘要
HIV-1 p24抗原作为一种早期表达且易于测量的生物标志物，在艾滋病的早期诊断中起着关键作用。然而，目前的检测方法通常存在灵敏度不足、操作繁琐以及反应步骤整合不佳的问题，这限制了其在快速现场诊断中的应用。本文开发了一种高灵敏度的微流控荧光生物传感平台，该平台独特地将基于G三链结构的荧光增强技术与熵驱动的催化（EDC）信号放大技术相结合用于p24的检测。设计的微流控芯片采用了微柱阵列来扩大反应表面积，并利用蛋白质A进行特异性抗体固定，从而提高了目标捕获效率。金纳米颗粒（AuNPs）将抗原的存在转化为核酸反应，触发EDC循环产生大量的输出链，这些输出链会展开形成发夹结构，诱导原位G三链结构的形成。这些G三链结构与硫黄素T（ThT）相互作用产生增强的荧光信号。包括抗原捕获、通过抗体和DNA共修饰的双功能AuNPs进行信号转导、EDC放大以及荧光读出在内的所有关键过程都集成在单个芯片上，简化了操作流程。该方法表现出优异的分析性能：检测限低至18.48 pg/mL，线性范围广泛（0.05 ng/mL至10 ng/mL），且具有高特异性。在临床应用中，其在添加了HIV样本中的回收率高达96.3%至106.4%。这种高度集成且多重信号放大的微流控平台不仅对早期HIV诊断具有巨大潜力，还为临床环境中其他低丰度生物标志物的高灵敏度检测提供了通用策略。
引言
p24衣壳蛋白是一种早期病毒抗原，其可在血清或血浆中比HIV特异性抗体早7至10天被检测到[1]。与依赖宿主免疫反应的抗体检测方法相比，p24检测能够提前约一周识别病毒，为及时进行临床干预和传播控制提供了宝贵窗口[1],[2]。近年来，开发了多种新的生物传感策略，如纳米材料辅助的电化学传感器[3]、催化免疫层析检测[4]和纳米机械检测系统[5]，以提高p24检测的分析灵敏度和整体性能。尽管取得了这些进展，但大多数现有检测方法仍依赖于离散且手动操作的步骤来完成目标捕获、信号放大和检测，缺乏连续且可控的反应环境。放大过程往往对环境变化敏感，导致不稳定性和重复性差，而依赖复杂仪器和频繁手动操作又增加了变异性并影响了系统的稳健性。因此，需要一种更加集成和稳定的传感方法，能够在统一的反应腔室内实现高效的目标捕获、可靠且可重复的信号放大以及稳定的检测结果。
最近，G三链/ThT系统作为一种无标记荧光读出技术受到了越来越多的关注。G三链由三个G链段组成，可以折叠成一种紧凑且热力学稳定的结构，与硫黄素T（ThT）结合产生强烈的荧光[6],[7]。与更常见的G四链/ThT复合物相比，G三链所需的序列较短，在较温和的离子条件下即可折叠[6]，并且提供了一种设计灵活、结构明确的无标记传感策略[8],[9],[10]。然而，当直接由低丰度目标触发时，G三链/ThT的荧光输出较弱，且由于折叠结构数量较少，信号可能会波动。为了解决这个问题，通常会先通过核酸放大来预放大目标信号再进行荧光转导。传统的酶辅助方法（如PCR和滚环扩增RCA）虽然灵敏度高，但需要酶、温度循环和复杂的操作[11]。相比之下，无酶放大策略（包括杂交链反应HCR、催化发夹组装CHA和熵驱动的催化（EDC）放大）依赖于可编程的杂交和链置换反应，具有简单性、低成本以及与多种传感模式的良好兼容性[12]。最近的研究证明了HCR和CHA的强大放大能力[13],[14],[15]。然而，这两种方法都需要多步骤的发夹结构打开过程，且容易受到自发泄漏的影响，反应动力学较慢。相比之下，EDC放大通过热力学上有利的熵增机制驱动高效的链置换，即使在目标丰度较低的情况下也能实现快速、抗泄漏的放大[16]。因此，将EDC放大与G三链/ThT读出技术结合，提供了一种稳健、无酶且高灵敏度的生物分子检测平台。
虽然核酸放大与G三链/ThT荧光读出的结合可以显著提高检测灵敏度，但传统方法仍涉及多个离散且手动操作的步骤，这可能导致上述的不稳定性和污染风险。微流控技术通过在一个微型平台上集成样品制备、放大和检测过程，提供了一个有效的解决方案。这种集成减少了试剂的使用量，缩短了检测时间，并通过精确的流体控制提高了重复性。此外，微流控系统天然适合自动化和多重检测，能够实现稳定且无污染的操作[17]。基于这些优势，多项研究已将各种检测策略集成到微流控平台中用于p24分析[18],[19],[20]。这些系统结合了血浆分离、免疫反应和芯片上的光学读出功能，实现了超低体积操作。然而，尽管取得了这些进展，许多系统仍依赖于外部泵送和流量控制，以及空间分离的功能模块，导致信号放大效率低下且在连续操作过程中缺乏稳定性。
在这项工作中，我们报道了一种荧光微流控生物传感平台，实现了完全集成的目标捕获、信号放大和荧光检测，用于早期HIV-1 p24分析。基于我们之前的设计[21]，使用葡萄球菌蛋白A（SpA）进行定向抗体固定，同时将AuNPs修饰为抗p24抗体和输入链。该系统继承了先前设计的优点，包括高效的抗体定向、增强的目标识别能力和高信号转换效率。与传统免疫测定方法不同，这种策略直接将抗原-抗体结合事件转化为可编程的核酸信号，触发EDC放大循环。放大的输出链随后诱导G三链结构的形成，这些结构与ThT结合产生强烈的荧光信号，从而实现完全无酶且高灵敏度的检测过程。通过在一个反应腔室内集成这些多重放大和转导步骤，我们的平台简化了操作流程，降低了污染风险，并显著提高了反应效率和稳定性。我们的平台在0.05–10 ng/mL的范围内对p24检测表现出良好的线性响应，检测限为18.48 pg/mL，具有优异的回收率和抗干扰能力，显示出其在早期HIV临床诊断中的巨大潜力。
微流控装置的设计、制备和修饰
微流控芯片设计了一个船形微通道，其中包含用于HIV-1 p24检测的圆形微柱阵列。船形反应室的宽度为2.8 mm，长度为3 mm，深度为150 μm。每个微柱的直径为200 μm，中心间距为400 μm。该芯片采用标准软光刻和复制成型技术制造[22]，详细协议见支持信息。
p24检测的整体策略
在这项工作中，我们开发了一种基于多重放大策略的荧光微流控生物传感器，通过结合G三链介导的荧光增强技术与EDC放大机制，实现了对p24的高灵敏度和快速检测（图1）。该传感方法使用了一种设计用于包含G三链形成序列的发夹DNA探针，该序列在与染料ThT结合时能够增强荧光信号。
结论
在这项研究中，我们开发了一种完全集成的微流控荧光生物传感器，结合了EDC放大和G三链介导的荧光转导技术，实现了对HIV-1 p24的高灵敏度检测。通过使用SpA介导的定向抗体固定和双功能AuNPs（将免疫识别转化为核酸信号），该系统实现了高效的目标捕获和稳健的信号启动。结合低泄漏的EDC放大和AuNP介导的局部富集，信号
CRediT作者贡献声明
邓志成：撰写——原始草稿、验证、方法学、正式分析、数据管理、概念构思。胡杰西卡：撰写——原始草稿、可视化、正式分析。朱雪明：方法学、数据管理。刘新怡：方法学、数据管理。王一芳：数据管理。范冰：资源获取、数据管理。高丹：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金申请、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了广东省纳米光子操控重点实验室开放基金（编号2023B1212010008）和深圳市科技创新委员会（编号JCYJ20180508152244835）的支持。
邓志成是清华大学深圳国际研究生院的硕士研究生，他的工作集中在开发用于芯片上检测HIV p24的新方法。
