《Sensors and Actuators B: Chemical》：SPECTRA-based Detection of Drug-Induced Hepatotoxicity through Extracellular Vesicle Analysis
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本研究提出SPECTRA方法，通过表面增强拉曼光谱与干涉显微镜结合，在30分钟内利用1.3微升外泌体样本实现乙酰氨基酚肝毒性剂量预测，误差低至1.50 mM，验证了外泌体作为肝毒性动态报告器的潜力。
乌古尔·帕拉尔塔南（Ugur Parlatan）|卢克·布德罗（Luke Boudreau）|胡利亚·托伦（Hulya Torun）|范乐涛（Letao Fan）|乌古尔·阿尤恩（Ugur Aygun）|阿伊塞·阿斯利汉·戈卡尔顿（Ayse Aslihan Gokaltun）|德米尔·阿金（Demir Akin）|O. 贝克·乌斯塔（O. Berk Usta）|乌特坎·德米尔吉（Utkan Demirci）
生物声学微机电系统在医学中的应用（BAMM）实验室，斯坦福大学医学院放射学系，加利福尼亚州斯坦福，邮编94304，美国
摘要
细胞外囊泡（EV）在液体活检、诊断和治疗应用中已成为关键目标，但对其纳米级别的表征仍具有挑战性。在此背景下，通过EV分子内容检测药物引起的肝损伤（即肝毒性）尚未得到充分研究。为此，我们提出了SPECTRA技术——一种结合表面等离子体增强、变换拉曼光谱和干涉显微镜的方法，可在30分钟内快速、无标记地分析EV内容，且仅需1.3微升样本。以肝细胞培养为模型，我们的平台能够捕捉到对乙酰氨基酚诱导的肝毒性反应中EV分子的变化。在不同培养组中，高斯过程回归模型预测乙酰氨基酚（APAP）剂量的中位绝对误差为1.50 mM，偏差极小（布兰德-阿尔特曼偏差约为0.03 mM）；交叉验证的均方根误差（RMSE）为3.145 mM。这些发现表明EV可作为细胞药物反应的动态指标，并展示了SPECTRA技术在检测肝毒性方面的应用。
引言
细胞外囊泡（EV）是由几乎所有细胞类型分泌的脂质双层包裹的纳米材料，能够运输生物活性蛋白[1]、脂质[1]和核酸[2][3]，从而介导细胞间通讯[4]。由于EV能够封装反映其母细胞生理状态的分子特征，它们在纳米生物材料研究[5]、药物递送[6]、医学成像[7][8]、生物医学诊断[9]和治疗开发[10][11]中发挥了重要作用。特别是，它们的分子载荷可用于无创监测细胞应激和毒性，使其成为研究药物诱导肝毒性的理想候选对象[12][13][14]。
药物引起的肝损伤（DILI），即肝毒性，仍是药物研发过程中失败[15][16][18]以及上市后撤市[19][20]的主要原因之一。标准的肝毒性评估方法（如肝酶检测、组织病理学评估和转录组分析）虽然不可或缺，但存在侵入性、操作繁琐和诊断精度有限的问题[21][22]。重要的是，EV已被证实与乙酰氨基酚（APAP）相关的肝损伤及相应的肝毒性机制有关，这支持了EV可以携带与损伤相关的分子特征的观点[13][14]。同时，EV群体本身具有异质性，分离/表征的选择会显著影响后续分析结果[23]；因此，在开发基于EV的检测方法时，必须遵循严格的报告和表征规范（例如MISEV2023）[24]。尽管EV与肝毒性有关，但将EV分子特征转化为快速、定量、剂量分辨的毒性指标的可靠框架仍然有限[25][26][27][28]。
表面增强拉曼光谱（SERS）是一种无标记的振动转换技术，通过等离子体纳米结构增强拉曼信号，实现灵敏的分子指纹识别[29]。尽管包括我们在内的多项研究[30]以及其他研究[31][32][33][34][35]已经探索了基于EV的SERS传感在诊断中的应用，但EV在测量药物诱导效应（包括无标记评估和快速分类细胞毒性）方面的潜力仍需进一步研究。许多EV-SERS生物传感方法通过免疫测定式的捕获方式（如基于抗体的识别）和相关亲和策略来提高选择性，但这本质上会富集特定类型的EV亚群，并需要预先了解目标[33][36]。此外，许多方法侧重于二元分类（例如健康细胞与病变细胞[40][41]），而非定量剂量-反应评估。因此，一个能够无偏、定量预测药物诱导毒性的无标记框架仍是一个亟待解决的需求。
本文的研究聚焦于一种细胞类型及其暴露于药物后EV的变化。我们提出了SPECTRA技术——一种结合表面等离子体增强、变换拉曼光谱和干涉显微镜的无标记方法，用于通过EV内容检测药物诱导的肝毒性。该平台利用基于SERS的平台（图1）通过分析EV内容，实现药物诱导肝毒性的定量预测/剂量分辨回归。我们使用暴露于乙酰氨基酚（APAP）的二维大鼠肝细胞培养物中的EV，分别在给药前（第0天）和给药后48小时（第2天）收集培养上清液，随后进行EV分离和表征。该方法使用1.3 μL的EV样本量，在一次性金纳米柱结构SERS表面上进行干燥处理。在30分钟内，我们通过捕捉药物暴露两天后EV载荷中的分子变化来量化APAP诱导的肝毒性。基于SERS光谱特征训练的回归模型成功预测了不同培养物中的APAP剂量，均方根误差（RMSE）低至1.50 mM。这项研究表明，EV-SERS集成是一种精确、无创且可扩展的肝毒性筛查方法，为改进临床前药物开发和毒性预测提供了新途径。
结果
我们采用基于SERS的无标记方法，评估了不同剂量APAP作用下大鼠原代肝细胞分泌的EV内容变化，这些变化反映了不同程度的肝毒性。随着APAP剂量的增加，肝细胞的存活率、功能性和形态完整性在两天内呈剂量依赖性下降（图2）。第2天的细胞存活率测量结果显示IC50值为14.55 mM（图2a）。同时进行的功能性检测表明……
讨论
在本研究中，我们展示了SPECTRA技术作为基于SERS的EV分析平台的潜力，能够通过剂量依赖的分子特征量化药物诱导的肝毒性。SERS强度在810–1600 cm?1范围内随APAP剂量的增加而持续下降，高斯过程回归（GPR）模型在不同数据集中的RMSE值低至1.50 mM。SERS强度随APAP剂量增加而下降可能是由于EV分泌减少所致……
细胞培养和分析材料
培养过程中使用了两种不同的细胞培养基。首先，使用含有高浓度葡萄糖（4.5 g/L）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Life Technologies，美国加州），并添加了10%胎牛血清（FBS，Sigma，美国密苏里州圣路易斯）、2%青霉素-链霉素、7.5 μg/mL氢化可的松、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）和14 ng/mL胰高血糖素，用于细胞接种和初始过夜维持。
作者贡献声明
O. 贝克·乌斯塔（O. Berk Usta）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源管理、项目统筹、方法学设计、资金获取、概念构思。乌特坎·德米尔吉（Utkan Demirci）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源管理、项目统筹、方法学设计、资金获取、概念构思。范乐涛（Letao Fan）：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、实验研究。乌古尔·阿尤恩（Ugur Aygun）：初稿撰写、数据可视化、结果验证、软件应用、正式数据分析。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT来优化文本流畅性。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益和个人关系：乌特坎·德米尔吉表示获得了斯坦福大学医学院的财务支持；奥斯曼·贝克·乌斯塔表示获得了美国国立卫生研究院的财务支持；乌古尔·阿尤恩表示获得了欧盟的财务支持。乌特坎·德米尔吉是以下公司的联合创始人并持有股权：（i）Vetmotl Inc.，（ii）LevitasBio，（iii）……
致谢
U.D. 感谢斯坦福大学PhIND中心的种子基金支持。我们还要感谢美国国立卫生研究院在项目编号R21GM140656（L.B.和O.B.U.）、R01AR081529（A.G.和O.B.U.）和R21GM136002（A.G.和O.B.U.）下的资助。U.A. 感谢欧盟“地平线欧洲”研究与创新计划（Marie Sk?odowska-Curie项目，项目编号101066038 [75]）的资助。
利益冲突
U.D. 是以下公司的联合创始人并持有股权：（i）……
乌古尔·帕拉尔塔南（Ugur Parlatan），博士，斯坦福大学放射学系生物声学微机电系统（BAMM）实验室的基础生命科学研究科学家。他于2017年在伊斯坦布尔技术大学获得物理学博士学位。他的研究兴趣包括拉曼光谱、光学镊子、光谱成像、细胞外囊泡分子指纹识别、数据驱动的诊断方法以及应用光学技术进行疾病检测。
