《Sensors and Actuators B: Chemical》：Portable biosensor for microRNA-21 based on the regulation of charge density in microchannel through CRISPR/Cas13a system using multimeter as readout
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本研究设计了一种基于CRISPR/Cas13a系统和微通道电阻传感器的便携式生物传感器，用于高灵敏度检测血清中的miRNA-21。通过CRISPR/Cas13a激活后，发夹DNA探针的断裂引起微通道表面电荷密度变化，导致电阻可测量变化。优化后，传感器检测限达1.41 fM（S/N=3），线性范围100 fM至10 nM，并成功应用于血清样本检测。
Jiexin Wu|Xiaoli Huang|Huabin Cai|Yiwei Xu|Xinjia Wang|Cuiying Lin|Fang Luo|Zhenyu Lin
中国福建省福州市福州大学化学学院，食品安全与生物学分析科学教育部重点实验室，福建省食品安全与健康分析与检测重点实验室
摘要
微小RNA（microRNAs）作为重要的生物标志物，在肿瘤的早期诊断和预后评估中具有巨大潜力。开发使用简单设备的高精度和灵敏度微小RNA检测策略至关重要。在本研究中，选择微小RNA-21作为模型目标，利用微通道的电阻变化作为检测指标，通过万用表可以轻松监测这一变化。首先在微通道内壁修饰了发夹DNA探针，由于其磷酸骨架带有大量负电荷，能够吸引电解质中的阳离子聚集在通道附近区域，形成高浓度的阳离子区，从而提高离子迁移速率并降低微通道的电阻。微小RNA-21的存在可以激活CRISPR/Cas13a系统，导致修饰后的DNA探针被切割，改变内表面电荷密度，进而增加电阻，这一变化可以通过万用表检测到。在优化条件下，微通道电阻与微小RNA-21浓度呈线性关系，检测范围为100 fM至10 nM，检测限达到1.41 fM（信噪比=3）。该传感器已用于血清样本中目标微小RNA的检测，并取得了满意的结果。
引言
微小RNA（miRNAs）是一类长度约为18–25个核苷酸的小型非编码RNA，对转录后的基因表达调控起着关键作用。它们在细胞增殖、分化和程序性细胞死亡等多种生理和病理过程中发挥着重要作用[1]、[2]。越来越多的证据表明，特定微小RNA的失调与多种人类疾病密切相关，包括癌症、神经系统疾病和代谢异常[3]。因此，微小RNA被广泛认为是具有临床价值的生物标志物，在肿瘤早期检测和预后评估方面具有巨大潜力[4]、[5]。然而，由于其分子量小、序列相似度高以及含量极低，其检测技术仍然具有挑战性，导致灵敏度不足、操作复杂且依赖专用仪器。尽管主流检测方法（如qRT-PCR[6]、Northern blotting[8]、microarray分析[10]）具有较高的分析精度，但这些方法通常耗时较长，需要复杂的仪器，无法满足即时诊断或快速筛查的需求[11]、[12]。基于这一需求，亟需开发灵敏度高、快速且操作简便的微小RNA检测方法，以支持疾病早期筛查、即时诊断和精准医疗。为此，基于电信号输出和现场操作能力的检测策略应运而生，成为该领域的发展方向。
近年来，微通道因其尺寸可控、界面可修饰性强以及电化学响应特性优良，成为微小RNA检测的有前景的平台[13]、[14]、[15]。微通道内壁提供了较大的比表面积，有利于探针分子的高密度固定，提高了目标识别的效率[16]、[17]。此外，微通道对其内表面电荷的变化非常敏感，其导电性可以通过表面功能基团、离子环境和分子识别事件进行调节。这些变化可以直接转化为可测量的电信号，如离子电流整流或电阻变化，体现了其在电信号转导方面的优异性能[18]、[19]。此外，该平台易于与便携式电信号输出设备（如万用表）接口[20]，为开发简单、快速、低成本的即时检测系统提供了有力支持。例如，Feng等人开发了一种基于二氧化硅纳米线-DNA纳米探针功能化玻璃微通道（SiNWs-DNA@GMC）的自下而上组装传感器，实现了超低检测限（6.61 × 10^-2拷贝/μL），并在9分钟内完成电化学读数，显示出其在临床病毒检测中的巨大潜力[21]。Xu等人构建了一种氨基酸功能化的UiO-66门控纳米通道，利用离子电流整流（ICR）特性在10 nM至10 mM的宽浓度范围内检测Co^2+离子，不仅提供了一种新的Co^2+检测平台，还揭示了Co^2+在纳米通道内的传输机制[22]。Huang等人开发了一种基于微通道的生物传感平台，结合CRISPR-Cas12a系统的高特异性和万用表读数功能，实现了对p53基因的超灵敏检测，检测范围为50 fM至50 pM，检测限低至15 fM，为疾病相关DNA目标的即时检测提供了有力工具[23]。这些研究共同证明了生物分子信号有效转化为可检测的电信号，为设计新一代高灵敏度、便携式生物传感器奠定了基础。
在各种生物识别工具中，CRISPR-Cas系统因其极高的特异性和高效的切割活性而在分子诊断中展现出显著潜力[24]、[25]、[26]、[27]。当CRISPR-Cas13a/crRNA复合物识别目标RNA时，会激活其非特异性RNase活性，无差别地切割报告基因RNA，从而成为构建高灵敏度生物传感器的有效信号放大机制[28]、[29]、[30]、[31]。基于微通道的电阻传感技术结合万用表读数方法最近受到关注[19]。本研究设计了一种简单、快速、低成本的微通道电阻传感器，用于检测微小RNA-21（作为模型目标）。该方法将CRISPR/Cas13a的切割活性与微通道电阻传感结合，利用数字万用表实现定量读数。微通道既作为核心传感元件，也作为生物分子反应的场所，能够实时监测电阻变化，万用表作为读数设备。微通道内壁修饰有带负电荷的发夹DNA探针，只有在目标微小RNA-21激活后才会被Cas13a/crRNA复合物切割。这种切割引起的表面电荷变化直接转化为可测量的电阻变化，进而改变微通道内的电解质离子富集和传输，导致电阻显著增加或导电性降低。因此，切割前后的电阻变化（ΔR）为微小RNA检测提供了灵敏的电信号。我们的方法具有操作简便、灵敏度高、检测速度快和系统集成性强等优点，为快速电生物标志物检测提供了一种创新方法。
试剂和设备
- 3.
氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、氯化钾（KCl）和无水乙醇由Macklin（中国上海）提供。TE缓冲液（1×溶液，低EDTA，pH 8.0）和经DEPC处理的水由Sangon（中国上海）提供。LawCas13a核酸酶（Cas13a）和10×Cas13a反应缓冲液来自Novoprotein Scientific Inc（中国上海）。本研究中使用的所有溶液均使用超纯水（Milli-Q，Millipore，美国）配制。
DNA
使用万用表作为读数的便携式微小RNA-21生物传感器原理
本研究提出了一种基于CRISPR/Cas13a-微通道电阻传感器的微小RNA检测方法（以微小RNA-21为例进行验证），采用万用表作为读数设备。如图1a所示，建立了功能性的闭合电化学电路。反应室和传感通道共享相同的电解质，一个Ag/AgCl电极位于反应室，另一个位于微通道中，两者均连接到万用表。
结论
本研究成功开发了一种基于CRISPR/Cas13a系统的便携式微通道生物传感器，用于微小RNA-21的检测，并在血清样本中验证了其应用效果，显示出满意的灵敏度、选择性和可靠性。目标微小RNA-21激活了Cas13a的切割活性，随后Cas13a非特异性地切割固定在微通道内壁的发夹DNA探针中的“rUrU”序列。
作者贡献声明
Jiexin Wu：撰写初稿、实验研究、数据分析。Xiaoli Huang：实验研究、数据分析。Huabin Cai：数据可视化、数据分析。Yiwei Xu：数据分析。Xinjia Wang：数据可视化、监督指导。Cuiying Lin：撰写、审稿与编辑、监督指导、概念构思。Fang Luo：资源协调。Zhenyu Lin：撰写、审稿与编辑、监督指导、方法学设计、资金申请。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本项目部分得到了国家自然科学基金（编号22374024）、广东省基础与应用基础研究基金（编号2023B1515230004）以及福建省科技创新联合基金（编号2023Y9088）的支持。
Jiexin Wu是福州大学化学学院的硕士研究生，她的研究方向是生物传感器的开发与应用。
