Lactucopicrin通过调控CCDC50棕榈酰化介导MAP2K4/MKK4自噬降解以延缓骨关节炎进展的机制研究

《Autophagy》：Lactucopicrin promotes the autophagic degradation of MAP2K4/MKK4 by mediating CCDC50 palmitoylation to alleviate osteoarthritis progression

本研究揭示天然化合物Lactucopicrin（LCP）通过直接结合棕榈酰转移酶ZDHHC4（锌指DHHC结构域蛋白4），增强其催化活性，促进自噬受体CCDC50（卷曲螺旋结构域蛋白50）的棕榈酰化修饰，进而驱动MAP2K4/MKK4（丝裂原活化蛋白激酶激酶4）经选择性自噬途径降解，最终抑制MAPK/JNK（丝裂原活化蛋白激酶/c-Jun N-末端激酶）信号通路活化，有效缓解软骨细胞衰老及骨关节炎（OA）病理进程。该研究首次阐明了ZDHHC4-CCDC50-MAP2K4/MKK4-MAPK/JNK调控轴在OA中的作用，为靶向蛋白修饰与自噬交互作用的OA治疗提供了新策略。

　　

骨关节炎的细胞衰老与自噬调控新机制

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）作为一种常见的退行性关节疾病，其发病机制与软骨细胞衰老及自噬功能失调密切相关。本研究聚焦于天然化合物Lactucopicrin（LCP）在OA中的保护作用及其分子机制。

LCP抑制小鼠OA进展和软骨退变

通过内侧半月板失稳（Destabilization of the Medial Meniscus, DMM）诱导的OA小鼠模型研究发现，LCP治疗能剂量依赖性地减轻软骨变薄、蛋白聚糖丢失及软骨结构破坏。组织学评分（OARSI评分）显示LCP显著改善软骨完整性。分子水平上，LCP下调OA相关分解代谢基因（如_Col10a1、_{Mmp13、Adamts5），并上调胶原蛋白COL2A1表达。同时，LCP降低衰老标志物（CDKN2A/p16^INK4a、CDKN1A/p21、TRP53/p53）及DNA损伤标记γH2AX的表达，证实其抗衰老作用。}

LCP通过抑制MAPK/JNK通路延缓软骨细胞衰老

转录组学分析提示MAPK/JNK信号通路是LCP作用的富集通路。在过氧化氢（H₂O₂）诱导的衰老软骨细胞中，LCP降低磷酸化MAPK/JNK（p-MAPK/JNK）水平，且特异性MAPK/JNK抑制剂JNK-IN-8可逆转LCP的抗衰老效应，表明LCP依赖该通路发挥作用。

LCP促进MAP2K4/MKK4的自噬-溶酶体降解

LCP选择性降低MAP2K4/MKK4蛋白表达，但不影响其mRNA水平。环己酰亚胺（CHX）追踪实验证实LCP加速MAP2K4/MKK4蛋白降解。自噬抑制剂3-MA和溶酶体抑制剂氯喹（CQ）可阻断此过程，而蛋白酶体抑制剂MG132无影响，表明降解途径为自噬-溶酶体依赖。在_Atg5或_Becn1敲除的细胞中，LCP无法诱导MAP2K4/MKK4降解，进一步验证自噬的必要性。

CCDC50作为MAP2K4/MKK4的自噬货物受体

通过基因敲除筛选发现，CCDC50是介导MAP2K4/MKK4降解的关键自噬受体。免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光显示LCP增强CCDC50与MAP2K4/MKK4的相互作用，并促进其与自噬标记蛋白LC3B的共定位。

LCP通过ZDHHC4催化CCDC50棕榈酰化

LCP不改变MAP2K4/MKK4或CCDC50的泛素化水平，但通过酰基-生物素交换（ABE）实验证实LCP显著增强CCDC50棕榈酰化。点突变实验显示Cys18是CCDC50棕榈酰化的关键位点，其突变体（C18S）废除LCP介导的MAP2K4/MKK4降解。棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸（2-BP）可阻断LCP效应。

LCP靶向ZDHHC4增强其酶活性

系统筛选发现ZDHHC4是催化CCDC50棕榈酰化的关键酶。LCP直接结合ZDHHC4的Z1结构域，分子对接显示其p-羟基苯甲酸基团与ZDHHC4的His72形成氢键。突变His72或酶活位点Cys179均废除LCP功能。体外棕榈酰化实验进一步证实LCP直接增强ZDHHC4活性。

结论与展望

本研究首次揭示LCP-ZDHHC4-CCDC50-MAP2K4/MKK4-MAPK/JNK轴在OA中的调控作用，阐明棕榈酰化修饰通过调控选择性自噬抑制软骨细胞衰老的新机制。LCP作为一种靶向蛋白修饰-自噬交互作用的先导化合物，为OA的疾病修饰治疗提供新方向。