《Redox Report》：Tramadol induced hypoxia signaling and paraptosis-like cell death in breast cancer cells via HIF-1α and ATF4 dependent pathways
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本综述深入探讨了临床常用镇痛药曲马多在乳腺癌治疗中的潜在新用途。研究揭示，曲马多可通过诱导内质网应激（ER stress）、激活缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及转录因子ATF4等关键信号通路，引发活性氧（ROS）积累、线粒体功能障碍及胞质空泡化，最终导致一种新型的非凋亡性程序性死亡——类副凋亡（paraptosis）。这一发现为克服乳腺癌（尤其是三阴性乳腺癌）的凋亡抵抗提供了新的治疗思路和药物重定位策略。
曲马多诱导乳腺癌细胞死亡的作用机制
曲马多选择性降低癌细胞活力并诱导转录重编程
研究首先评估了曲马多对MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞及非肿瘤源性MCF-10A乳腺上皮细胞的细胞毒性。结果表明，曲马多能剂量依赖性地抑制两种癌细胞的代谢活性，其中MCF-7细胞对曲马多的敏感性约为MDA-MB-231细胞的1.5倍，而MCF-10A细胞则表现出相对耐药性，提示曲马多具有癌症选择性的细胞毒性窗口。为探究其分子基础，RNA-seq分析显示，曲马多处理引起了MDA-MB-231和MCF-7细胞广泛的转录组重塑。基因集富集分析（GSEA）进一步鉴定出，在两种细胞中均一致富集了缺氧反应、未折叠蛋白反应（UPR）和活性氧（ROS）信号通路相关的通路。
曲马多触发缺氧样反应并在常氧条件下稳定HIF-1α
为验证曲马多是否能引发缺氧样细胞反应，研究使用了缺氧敏感探针进行流式细胞术分析。结果显示，曲马多暴露后，两种乳腺癌细胞中缺氧相关荧光均呈浓度依赖性升高，表明曲马多在环境氧水平正常的情况下诱导了伪缺氧状态。进一步通过蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）追踪HIF-1α蛋白的降解动力学，发现曲马多处理显著延长了HIF-1α的半衰期，证实其阻碍了该蛋白在常氧条件下的降解。免疫荧光染色和亚细胞分级分离western blotting分析均证实，曲马多处理促进了HIF-1α的核定位。定量PCR（qPCR）分析显示，曲马多剂量依赖性地上调了HIF-1α下游靶基因（BHLHE40, HMOX1, VEGFA）的表达，且这种上调可被HIF-1α抑制剂PX-478显著抑制，表明曲马多在常氧下通过促进HIF-1α核转位和靶基因表达激活了HIF-1α信号。
曲马多激活内质网应激相关的p-eIF2α/ATF4/CHOP信号通路并升高细胞内ROS水平
研究通过western blotting评估了三条主要UPR通路的参与情况。结果显示，曲马多对IRE1、ATF6和PERK蛋白表达的影响在MCF-7和MDA-MB-231细胞中存在差异，但均检测到p-eIF2α/ATF4/CHOP信号通路成分的激活。核质分级实验证实，曲马多诱导的ATF4可转位至细胞核。qPCR验证了RNA-seq中发现的ATF4下游靶基因（CHAC1, ATF3, JDP2）的表达在曲马多处理后呈一致上升趋势。由于ATF4和CHOP可协同刺激蛋白质合成相关基因的表达，翻译的重新激活可能导致ROS过量产生。流式细胞术分析表明，曲马多显著增加了两种乳腺癌细胞的胞质ROS水平，而线粒体ROS水平仅在MDA-MB-231细胞中显著升高，提示细胞类型特异性的线粒体氧化应激反应。
曲马多诱导MDA-MB-231和MCF-7细胞发生胞质空泡化和脂滴形成
为阐明曲马多诱导的细胞死亡类型，研究使用了多种抑制剂。结果显示，在MDA-MB-231细胞中，ROS清除剂NAC可挽救曲马多诱导的细胞死亡；而在MCF-7细胞中，NAC和PERK抑制剂GSK260414具有挽救作用。针对铁死亡、自噬、坏死性凋亡和凋亡的抑制剂均不能阻止曲马多诱导的细胞死亡。相差显微镜下观察到，曲马多处理后两种乳腺癌细胞中出现大量胞质空泡，且空泡数量随剂量和时间增加而增多，最终融合成大空泡导致细胞死亡。透射电子显微镜（TEM）进一步揭示了这些空泡的形态，包括含有细胞内物质的自噬空泡和空的脂滴。BODIPY染色和流式细胞术定量证实，曲马多显著增加了两种细胞中脂滴的积累。
曲马多诱导乳腺癌细胞自噬
吖啶橙（AO）染色显示，曲马多处理增加了代表酸性囊泡细胞器（AVOs）的红色荧光的大小和数量。使用DALGreen染料结合流式细胞术定量分析自噬活性，发现曲马多剂量依赖性地增强了两种细胞的自噬活性。Western blotting结果显示，曲马多显著诱导了自噬标志物LC3B-II蛋白的表达。这些发现共同证明曲马多可诱导乳腺癌细胞发生自噬。
曲马多诱导MDA-MB-231和MCF-7细胞线粒体功能障碍
MitoTracker染色显示，曲马多处理显著改变了乳腺癌细胞的线粒体形态，使其从管状分布变为聚集或分布范围缩小。JC-1染料检测发现，曲马多剂量依赖性地导致线粒体膜电位丧失。Seahorse XF细胞线粒体压力测试进一步证实，曲马多处理显著损害了线粒体的氧消耗率（OCR），并降低了基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力、非线粒体呼吸、质子漏和ATP产生。这些结果表明曲马多诱导线粒体发生了形态和功能上的改变。
曲马多诱导MDA-MB-231和MCF-7细胞发生类副凋亡
Western blotting分析显示，曲马多未引起PARP蛋白的切割，表明其未激活caspase级联反应，排除了典型的凋亡途径。同时，曲马多激活了p38和ERK信号通路，并在MDA-MB-231细胞中显著降低了Alix（由PDCD6IP基因编码）蛋白的表达。这些分子变化与类副凋亡的特征相符。
曲马多诱导的HIF-1α、ATF4或PDCD6IP基因敲除的MDA-MB-231细胞的形态学变化
利用CRISPR/Cas9技术敲除HIF-1α、ATF4和PDCD6IP（Alix）基因后，研究发现HIF-1α和ATF4的敲除显著减弱了曲马多诱导的MDA-MB-231细胞毒性，而PDCD6IP的缺失则增强了曲马多的细胞毒性。形态学观察显示，ATF4缺陷细胞中空泡化程度减弱；HIF-1α敲除细胞空泡化程度与对照相似，但细胞形态更完整，脱落和变圆的情况较少；而Alix缺失的细胞在曲马多处理后出现严重的形态恶化、变圆和脱落。这些结果提示，ATF4促进胞质空泡化，HIF-1α有助于维持细胞在应激下的完整性，而Alix则在此过程中起保护作用。
综上所述，本研究阐明了曲马多通过稳定常氧下的HIF-1α以及激活由氧化应激和ER功能障碍驱动的类副凋亡细胞死亡，从而损害乳腺癌细胞活力的双重作用机制。曲马多诱导的类副凋亡涉及ROS水平升高和内质网应激，汇聚于p-eIF2α/ATF4/CHOP信号轴，同时伴随自噬紊乱、线粒体损伤和脂滴积累，最终导致特征性的胞质空泡化。这一发现揭示了曲马多此前未被认识的抗癌机制，为其在克服乳腺癌（尤其是三阴性乳腺癌）凋亡抵抗方面的潜在治疗应用提供了新的理论依据。
