《ImmunoTargets and Therapy》：Upregulated BLM and RECQL4 in Osteosarcoma: Association with Poor Prognosis, Immune Cell Infiltration, and Inhibitory Effects of Sphingosine Kinase 1 Inhibitor II/Pilaralisib
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本研究通过生物信息学分析与细胞实验，系统揭示BLM和RECQL4在骨肉瘤（OS）中显著上调且与不良预后相关。研究发现二者通过异常甲基化、调控肿瘤代谢关键通路（如PI3K）及负向调节免疫细胞浸润（CD8+T细胞、巨噬细胞等）促进OS进展。筛选出的鞘氨醇激酶1抑制剂II（Sphingosine kinase 1 inhibitor II）和皮拉利西（Pilaralisib）可有效抑制143B细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制与下调BLM/RECQL4表达相关。该研究为OS的预后评估及靶向治疗提供了新型生物标志物和候选药物。
BLM与RECQL4在骨肉瘤中的表达与预后价值
转录水平分析显示，BLM和RECQL4在骨肉瘤（OS）组织中显著上调。性别分层分析发现男性患者BLM转录水平较低，而RECQL4水平较高，提示性别因素可能影响基因表达。生存分析表明低表达BLM或RECQL4的患者总生存期和无病生存期更长，证实二者可作为OS的独立预后指标。
遗传变异与DNA甲基化调控机制
在153例OS样本中，BLM和RECQL4的遗传变异率分别为9%和7%，主要表现为基因扩增和RNA水平异常。DNA甲基化分析发现BLM的cg06034771等CpG位点甲基化水平与患者生存显著相关，高甲基化患者预后较好。RECQL4的cg19996418位点低甲基化则与良好预后相关，表明表观遗传调控参与OS进展。
基因互作网络与功能富集
BLM及其邻近基因（ANGs）形成包含20个节点、38条边的蛋白互作网络，核心基因ARPIN-AP3S2等通过酶抑制活性、磷脂结合等分子功能调控蛋白磷酸化。RECQL4网络涉及42个节点和790条边，核心基因ADCK5等参与丝氨酸/苏氨酸激酶活性及DNA转录因子结合，共同调节细胞增殖与凋亡通路。
微RNA与激酶靶点筛选
BLM的miRNA靶点包括miR-127和miR-516-5p，而RECQL4受miR-19B和miR-381调控。激酶靶点分析显示PLK1、CDK1和AURKB与BLM表达相关，CDK1、PLK1和CDK2与RECQL4相互作用，这些分子均参与细胞周期调控和肿瘤侵袭过程。
免疫细胞浸润与免疫治疗响应
BLM高表达与B细胞、巨噬细胞和树突状细胞浸润负相关，RECQL4高表达则抑制CD8+T细胞和树突状细胞浸润。抗PD-1/CTLA-4/PD-L1治疗可显著下调BLM和RECQL4表达，提示免疫检查点抑制剂可能通过调节该通路增强抗肿瘤效果。
单细胞测序揭示细胞特异性表达
单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示BLM和RECQL4在恶性OS细胞（尤其是C13簇）中富集。细胞互作分析表明BLM+/RECQL4+的恶性细胞与单核/巨噬细胞、耗竭CD8+T细胞密切相互作用，可能塑造免疫抑制微环境。
靶向药物筛选与功能验证
鞘氨醇激酶1抑制剂II和皮拉利西在GDSC数据库中对OS细胞系显示出低IC50值（分别为3.29-187μM和0.573-740μM）和高AUC值（>0.928）。体外实验证实二者可浓度依赖性抑制143B细胞活力，40μM鞘氨醇激酶1抑制剂II和50μM皮拉利西分别使细胞迁移率下降至对照组的42%和38%，侵袭细胞数减少约60%。
基因沉默验证致病机制
siRNA沉默BLM或RECQL4后，Western blot显示蛋白表达下调超70%。伤口愈合实验和Transwell实验进一步证实基因沉默可显著抑制143B细胞迁移和侵袭能力，表明二者直接参与OS的恶性表型调控。
讨论与展望
BLM和RECQL4通过调控DNA稳定性、免疫微环境及关键信号通路（如PI3K/AKT）驱动OS进展。鞘氨醇激酶1抑制剂II和皮拉利西作为潜在治疗药物，其作用机制与基因表达调控网络密切相关。未来需在更多OS细胞系和临床样本中验证靶向治疗的可行性，并深入探索表观遗传调控与免疫治疗的协同机制。
