《Algal Research》：High substrate conversion efficiency of a starch-deficient
Chlorella vulgaris mutant under fed-batch heterotrophic fermentation
编辑推荐：
本研究的中文摘要：通过化学诱变筛选获得一株淀粉合成缺陷的微藻突变体SDM4，并在7L生物反应器中验证其异养发酵性能。转录组学分析表明，SDM4通过抑制淀粉合成（‘拉’策略）并激活糖酵解、脂肪酸合成及TAG组装途径（‘推’策略），实现碳代谢流高效重编程，显著提升TAG含量（较野生型提高1.8倍）和葡萄糖转化效率（提升36.64%），为工业级微藻生物柴油生产提供了新资源与理论依据。
吴桂梅|吴贵春|刘芳|姜兴龙|吴明灿
中国云南省大理市大理大学农业与生物科学学院，邮编671003
摘要
微藻的异养发酵是生物柴油商业化的关键途径，但其经济可行性受到高碳源成本和内在“碳分配”问题的制约，即碳优先转化为淀粉而非目标产物脂质。尽管已有研究通过阻断淀粉合成来提高脂质产量，但这些研究大多仅限于实验室规模，因此在模拟工业高密度发酵条件下的性能和分子机制仍是一个重要的知识空白。在本研究中，通过化学诱变筛选出一种缺乏淀粉合成的普通小球藻突变体SDM4，并在7升生物反应器中采用连续培养异养策略，系统地与其野生型（WT）进行了生长特性、生化组成和底物转化效率的比较。最终，通过比较转录组学分析了其高脂质表型的潜在分子调控网络。成功获得了一种几乎完全阻断淀粉合成的稳定突变体SDM4。在7升生物反应器中，SDM4的最终三酰甘油（TAG）含量占干重的16.9%，是WT的1.8倍。更重要的是，葡萄糖到TAG的转化效率从WT的0.038克/克提高到了SDM4的0.059克/克，从而将底物转化成本降低了36.64%，显示出显著的经济潜力。转录组分析揭示了一种复杂的协同“推-拉”机制：淀粉合成途径被显著抑制（“拉”），而糖酵解、脂肪酸合成和TAG组装途径则被系统激活（“推”），从而有效地重新编程了碳代谢流向脂质合成。本研究不仅提供了一种在模拟工业条件下具有优异生产性能和经济效益的微藻突变体SDM4，还首次系统地揭示了这种突变体在高密度异养环境中的全局代谢重编程机制。这些发现为未来高效微藻细胞工厂的合理设计提供了重要的理论基础和关键遗传靶点。
引言
日益严重的全球能源危机和气候变化迫使人类社会加快向可持续、低碳能源结构的转型[1]。在各种可再生能源解决方案中，来自微藻的第三代生物燃料被认为是替代化石燃料并实现碳中和的最有前景的途径之一，因为它们具有生长周期短、光合作用效率高且不与粮食作物争夺耕地等独特优势[2]。然而，要将这一巨大潜力转化为经济上可行的现实，需要克服传统自养培养的固有放大瓶颈，后者受到土地面积和光照穿透的限制[3],[4]。因此，独立于光照、能够实现高细胞密度、高生物质产量和精确工业控制的异养发酵模式被广泛认为是推进微藻生物燃料和其他高价值化合物商业化生产的关键技术途径[5],[6]。
尽管异养发酵具有巨大的工业潜力，但其商业化仍面临几个主要瓶颈，最显著的是有机碳源的高成本和内在的细胞代谢限制[7]。在代谢水平上，一个关键的科学挑战在于碳分配。在异养条件下，微藻细胞倾向于将大量有价值的有机碳转化为储存多糖淀粉，而非目标产物三酰甘油（TAG）[5],[8]。这种内在的代谢竞争导致底物转化成本增加和经济效率降低。关键的是，关于淀粉和脂质之间代谢竞争的大多数研究仅限于实验室规模的自养或混合营养条件，目前尚不清楚这些结论是否适用于工业相关的高密度异养发酵系统[9],[10],[11]。这一知识空白阻碍了真正高效和可持续生物工艺的发展，而这是清洁生产的核心原则。
解决碳分配问题的最直接策略是通过代谢工程阻断淀粉合成，从而“推动”碳代谢流向脂质合成途径。与需要精确遗传信息的理性设计相比，随机诱变结合高通量筛选的策略在发现适合工业环境的具有意外、全局优化表型的突变体方面具有独特优势[12],[13]。因此，本研究的中心假设是，通过化学诱变可以获得一种能够在工业高密度异养发酵环境中茁壮成长的缺乏淀粉合成的突变体，在模拟实际生产条件下实现脂质产量和碳源转化效率的双重突破。
在本研究中，我们对普通小球藻进行了化学诱变，成功筛选出一种缺乏淀粉、高脂质产量的突变体SDM4。我们首次在7升生物反应器中对该突变体进行了系统的高密度连续培养，并利用比较转录组学揭示了其在模拟工业条件下的全局代谢重编程机制。这项研究不仅获得了一种具有显著工业应用潜力的微藻菌株，更重要的是，填补了实验室筛选与基于生物反应器的过程评估之间的关键空白。基于这些发现，我们提出了一种评估工业菌株经济潜力的新范式及其潜在分子调控的新模型。
藻株和培养条件
本研究中使用的普通小球藻野生型（WT）菌株FACHB-9来自中国科学院水生生物学研究所的淡水藻类培养库（FACHB）。该菌株在大理大学农业与生物科学学院水生生态学团队的实验室中维持和繁殖[9]。用于接种物制备的储备培养物在标准BG-11培养基中光自养培养[14]。培养过程
缺乏淀粉合成突变体SDM4的筛选与鉴定
为了获得能够将碳代谢流向从淀粉合成重新导向脂质积累的微藻突变体，对野生型普通小球藻进行了使用化学试剂甲基磺酸乙酯（EMS）的随机诱变处理。EMS主要通过烷基化鸟嘌呤（G）碱基来诱导点突变，导致DNA复制后G:C转变为A:T（图1A）。
为了确定最佳的诱变条件，研究了不同EMS浓度和处理效果
通过随机诱变实现协同“推-拉”策略的SDM4模型
将光合作用或异养作用固定的碳从主要储存形式（如淀粉）重新导向目标产物（如三酰甘油（TAG）是提高微藻脂质产量的代谢工程中的核心策略[19]。这通常需要复杂的“推-拉”协同调控。一方面，采用“拉”策略通过抑制或敲除竞争途径（如淀粉合成）来增加前体的可用性
结论
本研究通过化学诱变和高通量筛选成功获得了一种缺乏淀粉合成、高脂质产量的普通小球藻突变体SDM4，该突变体在工业应用方面具有显著潜力。这种突变体将其碳储存模式从淀粉彻底转变为脂质，使得三酰甘油（TAG）含量比野生型提高了1.8倍。至关重要的是，这导致其体积TAG产量达到了2.98克/升·天
作者贡献声明
吴桂梅：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。 吴贵春：正式分析。 刘芳：正式分析。 姜兴龙：正式分析。 吴明灿：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资金获取。
作者声明
吴桂梅构思并设计了实验，吴贵春进行了实验数据分析和数据处理。刘芳和姜兴龙执行了实验。吴明灿和吴桂梅负责资金获取并撰写了论文。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
吴明灿报告获得了海南省自然科学基金高层次人才项目的财务支持。吴明灿还报告获得了国家自然科学基金的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响研究结果致谢
本研究得到了海南省自然科学基金高层次人才项目（项目编号：323RC426）和国家自然科学基金（项目编号：22568003）的支持。
