《Aquaculture》：The phylogenetics and pathogen population dynamics of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in global shrimp populations
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IHHNV病毒全球进化动力学及流行病学特征研究，基于126个衣壳蛋白和63个NS1基因序列分析，揭示其突变率分别为4.5×10^-4和1.9×10^-4 substitutions/site/year，共同祖先追溯至1980年代初，存在1990年代至2010年代初的种群扩张及2010年代中期的衰退。地理结构显著，国际传播与养殖集约化相关，需加强分子监测和生物安全防控。
埃马纽埃尔·奥福里-阿姆蓬萨（Emmanuel Ofori-Amponsah）| 玛丽亚·安德拉德·马丁内斯（Maria Andrade Martinez）| 迈克尔·T·米汉（Michael T. Meehan）| 凯利·康登（Kelly Condon）
澳大利亚汤斯维尔詹姆斯库克大学医学院和牙科学院
摘要 自20世纪80年代出现以来，传染性皮下和造血坏死病毒（IHHNV）一直对全球虾类养殖业构成持续威胁，其传播因养殖规模的扩大和国际贸易的增加而加剧。尽管之前的研究主要集中在区域性的疫情爆发上，但IHHNV的全球进化动态仍知之甚少。本文分析了126个IHHNV衣壳蛋白序列（其中107个来自GenBank，19个为新收集的澳大利亚昆士兰北部样本）以及63个NS1基因序列（44个来自GenBank，19个来自澳大利亚昆士兰北部），这些样本收集自1986年至2022年间的12个国家。贝叶斯聚合分析估计衣壳区域的平均核苷酸替换率为4.5×10^-4（95%置信区间2.8×10^-4至6.4×10^-4）个替换/位点/年，NS1区域的替换率为1.9×10^-4（95%置信区间1.1×10^-4至2.8×10^-4）个替换/位点/年，这一结果与之前的地区性研究结果一致。最近共同祖先的时间可追溯到20世纪80年代初（95%置信区间：1976–1986年）。人口统计重建显示，该病毒在20世纪90年代和21世纪初经历了指数级增长，随后在2010年代中期出现下降。系统发育分析揭示了显著的遗传多样性和强烈的地理结构，同时存在一些病毒国际传播的证据。不同的区域SNP模式反映了系统发育结构，支持病毒进化受到地理限制的观点。IHHNV的高进化速率和全球分布特征凸显了持续进行分子监测和加强生物安全措施以降低未来疫情风险的必要性。
引言 传染性皮下和造血坏死病毒（IHHNV）是一种属于细小病毒科（Parvoviridae）Penstylhamaparvovirus属的单链DNA病毒（Shike等人，2000年；Yu等人，2021年）。该病毒在20世纪80年代首次出现，导致Penaeus stylirostris大量死亡，并被报道与Penaeus vannamei的矮小畸形综合征（RDS）相关，表现为生长减缓和身体畸形（Bell和Lightner，1984年；Castille等人，1993年），以及Penaeus monodon亲本的疾病（Primavera和Quinitio，2000年）。
IHHNV基因组长约4 kb，编码三个开放阅读框（ORFs）：NS1（2001 bp）、NS2（1092 bp）和衣壳蛋白（990 bp）（Rai等人，2012年；Shike等人，2000年）。在这三种基因型中，I型和II型具有传染性，而III型无传染性，属于内源性病毒元件（EVEs）（Aranguren Caro等人，2022年；Dhar等人，2022年）。
准确快速地检测IHHNV对于虾类养殖中的亲本筛选和疾病监测至关重要。除了传统的PCR和qPCR方法外，还开发了几种等温扩增技术。环介导的等温扩增（LAMP）方法包括原位DIG标记的LAMP（ISDL）检测方法，该方法在组织切片中直接检测IHHNV，具有更高的灵敏度和更快的检测速度（Jitrakorn等人，2016年）；双目标比色LAMP（D-LAMP）可扩增Penaeus stylirostris densovirus的两个基因组区域，同时减少EVEs的假阳性结果（Arunrut等人，2019年）；以及实时三重LAMP方法，通过浊度计监测，适用于常规现场检测，性能与qPCR相当（Arunrut等人，2024年）。重组酶聚合酶扩增（RPA）方法也包括实时RPA（针对基因组序列868–1000位点，Xia等人，2015年）和侧向流动试纸条（LFD）检测方法（针对基因组序列3094–3214位点，Jaroenram和Owens，2014年，参考GenBank编号272315）。这些方法共同证明了IHHNV检测的诊断和流行病学意义，并为有效监测和管理虾类种群中的感染提供了工具。
20世纪80年代初，IHHNV首次在夏威夷的蓝虾（Penaeus stylirostris）幼体中被发现（Lightner等人，1983年），随后在1990年的墨西哥（Lightner，1992a，Lightner，1992b）以及其他中美洲和南美洲国家（dos Santos Braz等人，2009年；Lightner，1992b；Lightner等人，1983年）也被发现。IHHNV引发的早期疫情凸显了该病毒的致病性，促使养殖方式发生了重大转变，人们用生长速度较慢但抵抗力更强的Penaeus vannamei取代了生长速度较快的Penaeus stylirostris（Alday-Sanz等人，2020年；Dhar等人，2019年；Fulks，1992年）。转向Penaeus vannamee的养殖方式减少了IHHNV对全球虾类生产的影响（Wyban，2007年）。20世纪90年代初，IHHNV也在澳大利亚的黑虎虾（Penaeus monodon）中被确认（Krabsetsve等人，2004年；Owens，1992年），随后在东南亚和太平洋地区得到报道，1996年在菲律宾（Belak等人，1998年）和2000年在泰国（Chayaburakul等人，2004年；Tang等人，2003年）也有发现。21世纪，IHHNV继续向东传播，印度尼西亚（Sunarto等人，2000年）、中国（Yang Bing等人，2007年）、印度（Praveen Rai等人，2009年）和韩国（Kim等人，2011年）也都有相关报道。在非洲，马达加斯加（Tang等人，2000年；Tang和Lightner，2006年）和莫桑比克（Tang和Lightner，2006年）的Penaeus monodon中发现了非传染性的IHHNV形式（EVEs）。最近在加拿大的Penaeus vannamei（2019年）和英国（2019年；CEFAS，2019年）中也检测到了IHHNV，这表明该病毒仍在全球范围内传播，这种传播可能得益于国际贸易、跨界亲本运输以及养殖规模的扩大（Lightner，1996年；Lightner，1999年）。
IHHNV作为病原体的影响程度不一，关于其对野生和养殖虾类生长、健康和存活率的影响存在矛盾的记录（Arbon等人，2022年；Jaroenram和Owens，2014年；Saksmerprome等人，2010年）。尽管IHHNV已被长期发现，但对其全球种群结构和进化动态的了解仍然有限。先前的系统发育研究探讨了特定地区IHHNV的遗传多样性和进化速率，估计的替换率范围为约1.39×10^-4（Robles-Sikisaka等人，2010年）至1.55×10^-3（Jaroenram等人，2015年）个替换/位点/年。Robles-Sikisaka等人（2010年）发现遗传多样性高于之前的报道，有效种群规模的变化与流行病学记录一致。Jaroenram等人（2015年）专注于澳大利亚的样本，推断出1991年后感染数量逐渐下降，1996年有所回升，此后保持稳定。然而，像Robles-Sikisaka等人（2010年）和Jaroenram等人（2015年）的研究包含了内源性病毒元件（EVEs），这可能影响了进化推断的准确性。此外，大多数先前的研究仅关注衣壳或NS1基因，全球采样范围有限，从而限制了我们对IHHNV更广泛进化动态、传播模式和人口历史的理解。
本研究分析了来自澳大利亚昆士兰北部的新生成的IHHNV序列等全球多样化的数据集。我们应用了严格的筛选标准排除了EVEs和其他问题序列，同时分析了衣壳和NS1基因，以重建进化关系、估计替换率并推断历史种群动态。我们的结果为IHHNV的全球结构、多样性和人口统计提供了新的见解，对养殖业中的病毒监测和控制具有指导意义。
基因库数据检索 传染性皮下和造血坏死病毒（IHHNV）的衣壳、NS1和全基因组序列是从GenBank中检索到的（检索日期：2024年8月13日，网址：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank ）。纳入标准要求序列完整或至少包含80%的基因组长度，带有采集日期和宿主物种信息，并有已发布的元数据支持。仅保留了来自虾类宿主的序列（表1）。缺乏采集日期或其他必要信息的序列被排除。
序列概述与比对 本研究分析了126个IHHNV核苷酸序列，其中包括19个来自澳大利亚昆士兰北部的新全基因组序列和107个从GenBank获取的公开序列，其中包含44个全基因组和63个衣壳特异性序列。为了后续分析，还从全基因组中提取了63个NS1区域。这些序列的详细信息（包括位置、数量、宿主物种、采样日期和参考文献）在表1中提供。
讨论与结论 我们对126个IHHNV序列的贝叶斯系统发育分析估计，衣壳区域的平均替换率为4.5×10^-4（95%置信区间2.8×10^-4至6.4×10^-4）个替换/位点/年，NS1区域的替换率为1.9×10^-4（95%置信区间1.1×10^-4至2.8×10^-4）个替换/位点/年。我们估计的衣壳区域突变率处于RNA病毒突变率范围（10^-3至10^-5）之内（Jenkins等人，2002年；Scholtissek，1995年），尽管略高于Kim等人报告的平均值。
作者贡献声明 埃马纽埃尔·奥福里-阿姆蓬萨（Emmanuel Ofori-Amponsah）： 撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、软件使用、资源准备、方法学设计、调查实施、数据分析、数据整理、概念构思。
玛丽亚·安德拉德·马丁内斯（Maria Andrade Martinez）： 资源准备、调查实施、数据整理。
迈克尔·T·米汉（Michael T. Meehan）： 撰写 – 审稿与编辑、监督工作、资源协调、项目管理、方法学设计、资金获取、概念构思。
凯利·康登（Kelly Condon）： 撰写 – 审稿与编辑、监督工作、资源协调、项目执行。
未引用的参考文献 Chai等人，2016年；Killian等人，2020年；Salcedo-Mejia等人，2022年；Wang XiaoShan等人，2017年
利益冲突声明 作者声明他们与本文所述工作无任何可能影响其公正性的财务或个人关系。
致谢 M.T.M.和E.O.A.获得了澳大利亚研究委员会（Australian Research Council）的发现早期职业研究员奖（DE210101344）的支持。
