TRAF6通过激活AKT信号通路和损伤线粒体来增强对铁死亡（ferroptosis）的防御机制，这在由KRAS基因驱动的肺癌中尤为明显

《Biochemical Pharmacology》：TRAF6 promotes the ferroptosis defense through AKT/mitochondria damage in KRAS-driven lung cancer

KRAS突变肺癌中TRAF6通过AKT通路调控线粒体铁依赖性细胞死亡，抑制TRAF6可增强RSL3诱导的 ferroptosis，并促进新型抑制剂PGG的发现与验证。

　　

余伟邦|崔一文|李思新|罗连香

广东医科大学海洋与热带医学院，中国广东省湛江市524023

摘要

铁死亡（Ferroptosis）是一种依赖铁的细胞死亡形式，在癌症治疗中具有潜在作用，但其在大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）突变肺癌中的调控机制仍不明确。本研究发现肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）是KRAS驱动肺癌中依赖线粒体的铁死亡的关键驱动因子。TRAF6的抑制会增加脂质过氧化、线粒体活性氧（ROS）和Fe²⁺的积累，从而加剧线粒体损伤并增强RAS选择性杀伤蛋白3（RSL3）诱导的铁死亡。TRAF6的基因沉默会损害抗氧化信号通路，并显著抑制体内KRAS突变肺癌的生长。机制上，TRAF6直接与蛋白激酶B（AKT）相互作用，导致线粒体损伤和铁死亡，这一过程可通过AKT过表达或线粒体抗氧化治疗得到逆转。通过虚拟筛选，我们发现了一种新型的TRAF6靶向抑制剂——五聚没食子酰葡萄糖（PGG）。PGG能有效结合并降解TRAF6，触发线粒体铁死亡，并显著抑制KRAS突变肺癌的生长，但其效果可被铁死亡阻断机制部分逆转。这些发现揭示了一个此前未被认识的TRAF6/AKT介导的线粒体铁死亡通路，并表明PGG是一种有前景的KRAS突变肺癌治疗候选药物。

引言

大鼠肉瘤（RAS）突变是多种癌症中最常见的致癌驱动因素之一，位于12号染色体上，与肿瘤的发生和发展密切相关[1]。RAS蛋白是小的鸟苷三磷酸酶（GTPases），在受体酪氨酸激酶信号通路中起二进制开关作用，包括表皮生长因子受体、间充质-上皮转化因子和间变性淋巴瘤激酶介导的通路[2]。致癌性Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）突变会破坏RAS的GTP酶活性，导致活性GTP形式的持续积累和下游信号的持续激活。RAS突变占所有人类癌症的近三分之一，其中KRAS是最主要的亚型（约85%），可引发多种致命恶性肿瘤，包括非小细胞肺癌（NSCLC）[3]。NSCLC是全球癌症相关死亡率最高的类型（约20%）[4]，在实际病例中约20%存在KRAS突变，仅次于EGFR突变[5]。值得注意的是，西方人群中KRAS突变率约为30%–34%[5]，而亚洲人群中这一比例较低，为10%–15%[7]。

目前，sotorasib和adagrasib已被批准用于治疗携带KRAS^G12C突变的患者。其中，sotorasib于2021年首次获得FDA批准，适用于至少接受过一线系统治疗的KRAS^G12C突变NSCLC患者[8]。临床试验结果显示，sotorasib的客观反应率（ORR）为37.1%，中位无进展生存期（PFS）为6.8个月，而标准治疗的ORR为23%，PFS为4.5个月[9]。Adagrasib也是针对KRAS^G12C突变的抑制剂，2022年获得FDA加速批准，作为二线治疗药物用于携带该突变的转移性NSCLC患者[8][10]。该批准基于KRYSTAL-1试验（NCT03785249），其中adagrasib的ORR为42.9%，中位PFS为6.5个月[10]。然而，患者通常在六个月内就会出现耐药性[11]。对于没有可靶向驱动突变的晚期NSCLC患者，免疫疗法已成为标准的一线治疗手段，无论是单独使用还是联合治疗。在单药治疗中，PD-L1肿瘤比例评分大于50%的患者在接受PD-1抑制剂perbrolizumab治疗后，中位PFS为7.7个月，而仅接受化疗的患者为5.5个月[12]。此外，pembrolizumab与化疗的联合使用进一步改善了治疗效果，中位PFS为9.0个月，而单独化疗为4.9个月[13]。尽管取得了这些进展，但长期临床疗效仍然有限：只有约20%的患者能够实现疾病控制；约20%的患者在初始稳定后出现疾病进展，高达60%的患者会出现延迟进展[14]。因此，KRAS突变肺癌患者的预后仍然较差，迫切需要新的、更有效的治疗策略。

KRAS突变肺癌细胞表现出显著的代谢改变，尤其是在线粒体和脂质代谢方面，这些改变赋予了癌细胞生长优势并有助于免疫逃逸[15]。先前的研究表明，KRAS突变增强了脂肪酸合成、脂肪酸氧化和脂质摄取，表明代谢异质性是KRAS驱动肿瘤的特征[16][17]。铁死亡是一种由铁依赖的脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，与脂质代谢失衡密切相关[18]。肿瘤特异性代谢重编程，包括脂肪酸代谢的改变，使KRAS突变癌细胞特别容易发生铁死亡[19]。事实上，无论是基因还是药物诱导的铁死亡都显示出良好的临床前效果[17][20]。针对RNA结合蛋白DEAD-box螺旋酶3的蛋白水解作用可破坏半胱氨酸和谷胱甘肽代谢，从而触发KRAS驱动的肺癌中的铁死亡[21]。类似地，脂肪酸合成酶抑制剂（如TVB-3664）可增加活性氧（ROS）和脂质过氧化，抑制KRAS突变细胞的增殖[17]。这些发现表明，诱导铁死亡是治疗KRAS突变肺癌的一个有前景的途径。

肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）属于TRAF家族中的适配蛋白，通过与肿瘤坏死因子和白细胞介素-1等受体相互作用，调节多种信号通路，从而影响基因表达、细胞存活和免疫反应[22][23]。最新研究表明，KRAS突变会促进TRAF6的自 ubiquitination和下游激活，而TRAF6缺陷细胞在体内无法形成肿瘤[24]。TRAF6的基因或药物抑制可抑制肺癌的进展和转移[25][26]，表明TRAF6与KRAS突变肺癌的进展密切相关。此外，越来越多的证据表明TRAF6参与铁死亡的调控。某些化合物（如Sennoside A）可通过调节TRAF6信号通路来调节铁死亡[27][28]。TRAF6-p62轴通过自噬降解重要的抗铁死亡酶谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）来诱导铁死亡[29]。因此，我们提出阻断TRAF6可能是使KRAS驱动癌细胞更易发生铁死亡的有效策略。

在本研究中，TRAF6阻断诱导了KRAS突变肺癌的线粒体功能障碍和铁死亡。TRAF6可能通过线粒体损伤信号通路在KRAS驱动的肺癌中发挥关键调节作用。除了通过TRAF6敲低（TRAF6-KD）细胞建立和移植来验证其体内疗效外，还将探讨TRAF6在蛋白激酶B（AKT）-线粒体损伤通路中的详细机制。我们将筛选针对TRAF6的小分子化合物，并通过铁死亡实验进一步验证其效果。

实验方法

细胞培养

NCI-H358、NCI-H2122和A549细胞购自上海细胞库（中国上海）。这两种细胞系在含有10%胎牛血清（Gibco，美国格兰德岛）、100 U/mL青霉素（Gibco，美国格兰德岛）和0.1 mg/mL链霉素（Gibco，美国格兰德岛）的RPMI-1640完全培养基中培养，并在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中维持。

siRNA转染

NCI-H358和NCI-H2122细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种到6孔板中。

TRAF6的抑制诱导了KRAS驱动肺癌中的铁死亡

鉴于TRAF6在癌症发展中的关键作用，我们首先研究了其与KRAS突变的关系。TRAF6表达与KRAS表达呈正相关（图1A&B）。在KRAS突变细胞系NCI-H358（KRAS突变，TP53缺失）、NCI-H2122（KRAS突变，TP53突变）和A549（KRAS突变，TP53野生型）中，单独沉默TRAF6可显著抑制96小时后的细胞增殖（图1C-E）。在NCI-H358细胞中，72小时时也出现了轻微的抗增殖效应。

讨论

我们的研究首次证明TRAF6阻断可通过AKT通路诱导KRAS突变肺癌的线粒体功能障碍和铁死亡。为了开发高效的TRAF6靶向抑制剂，我们建立了虚拟筛选平台，并成功鉴定出PGG这种对TRAF6具有强结合亲和力的新型化合物。后续验证实验确认，PGG不仅能够结合TRAF6，还能促进其降解，从而发挥潜在的治疗作用。

CRediT作者贡献声明

余伟邦：撰写初稿、实验设计、资金获取、数据分析。崔一文：结果验证、方法学研究。李思新：结果验证、软件操作。罗连香：撰写、审稿与编辑、实验监督。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了省级人才发展战略专项基金（编号2SC24010）和广东省医学研究基金（编号A2025090）的支持。