PFKFB4介导的HSPB1磷酸化抑制铁死亡（ferroptosis），从而促进胃癌进展

《Biochemical Pharmacology》：PFKFB4-Mediated HSPB1 phosphorylation suppresses ferroptosis to Promote gastric cancer progression

胃 cancer（GC）患者预后差，铁死亡作为新型细胞死亡机制，其抑制因子HSPB1被PFKFB4磷酸化调控。本研究发现PFKFB4在GC中高表达，通过磷酸化HSPB1抑制铁死亡，5MPN抑制剂可阻断PFKFB4活性，增强铁死亡并抑制肿瘤生长。

　　

马梦迪|徐欣|于可迅|杨雄伟|强卫东|达尔·埃姆雷|张永红|朱江润|孙若川|张尚鑫|李永祥

安徽医科大学第一附属医院普通外科，中国合肥230022

摘要

胃癌（GC）是全球发病率和死亡率的主要原因之一；尽管近期治疗手段有所进步，但由于诊断不及时和治疗耐药性，总体预后仍然较差。在肿瘤进展和治疗脆弱性的新兴机制中，铁死亡（ferroptosis）被定义为一种依赖铁的调节性细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化过程，越来越多地被认为与包括胃癌在内的多种恶性肿瘤的发病和进展有关。同时，代谢重编程被认为是癌症的一个标志，其中6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4（PFKFB4）作为一种关键的双功能代谢酶而受到关注。通过调节细胞内果糖-2,6-二磷酸的水平，PFKFB4调控糖酵解和戊糖磷酸途径（PPP）之间的平衡，从而支持氧化还原稳态和合成生长。值得注意的是，最近的研究发现PFKFB4在多种恶性肿瘤中异常过度表达，这表明它与肿瘤进展有关。基于此，在本研究中，我们证明了PFKFB4在胃癌细胞中显著过度表达，并通过与热休克蛋白β-1（HSPB1）的直接相互作用及其磷酸化来调节其对铁死亡的敏感性，而HSPB1是铁死亡信号传导的关键负调节因子。重要的是，使用PFKFB4的特异性抑制剂5MPN处理可以显著增强铁死亡细胞死亡并抑制胃癌肿瘤生长。这些发现揭示了PFKFB4在胃癌中的新功能，超出了其传统的代谢作用，包括主动调节铁死亡，从而促进癌症进展。因此，药理学抑制PFKFB4代表了一种有前景的治疗途径，用于克服铁死亡耐药性和抑制胃癌的进展。

引言

胃癌（GC）是一个重大的全球健康问题，经常被列为世界上最常见和致命的癌症之一。尽管近年来总体发病率有所下降，但疾病负担仍然很大。根据GLOBOCAN 2020数据库的数据，每年约有107万新病例，胃癌是全球第五大常见癌症。此外，胃癌仍然是癌症相关死亡的主要原因，排名第四，每年导致近77万人死亡[1]。

胃癌的发病机制是多因素的，涉及遗传易感性、环境暴露和微生物感染的复杂相互作用[2]。其中，幽门螺杆菌（H. pylori）的慢性感染已被确定为最重要的致病因素，并被国际癌症研究机构（IARC）列为I类致癌物[3]。同时，各种可调节的风险因素也与胃癌的发展有关，例如高盐饮食和经常食用熏制或腌制食品，这些都与黏膜炎症和上皮损伤增加有关[4]。吸烟被认为是一个独立的风险因素，过量饮酒，尤其是高浓度酒精，可能会进一步增加胃黏膜恶性转化的风险[5]。

目前，手术切除仍然是主要的治疗方法，特别是对于早期和局部胃癌[6]。在晚期疾病或手术后作为辅助治疗时，系统性化疗仍然是临床管理的主要手段。放疗则更具有选择性，通常起辅助作用[7]。尽管有这些治疗干预措施，总体预后仍然较差，特别是对于晚期诊断的患者。最近加入免疫检查点抑制剂（ICIs）在部分晚期胃癌患者中显示出令人鼓舞的结果[8]；然而，长期生存率仍然很低，治疗耐药性也很常见[9]。

因此，迫切需要阐明驱动胃癌发展和进展的分子机制。识别和表征新的治疗靶点和预测性生物标志物对于提高胃癌的诊断精度和治疗效果至关重要。

铁死亡是一种依赖铁的程序性细胞死亡类型，其特征是脂质过氧化物（尤其是多不饱和脂肪酸（PUFAs）的显著积累，这是通过铁催化的芬顿反应介导的，最终会破坏膜完整性并导致细胞死亡[10]，[11]。最近的研究强调了铁死亡在多种病理状况中的关键作用，包括癌症，它既作为一种肿瘤抑制机制，也作为治疗反应的决定因素。值得注意的是，某些癌细胞通过上调保护性抗氧化系统（如谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和铁死亡抑制蛋白1（FSP1）来获得对化疗或免疫治疗剂诱导的铁死亡的抵抗力，这些系统可以解毒脂质过氧化物并维持氧化还原稳态[12]，[13]。因此，诱导或恢复铁死亡已成为一种有前景的抗癌策略，提供了克服耐药性和提高治疗效果的手段[14]，[15]。然而，铁死亡靶向疗法的转化应用需要进一步的机制研究和繁琐的安全性评估，以确保临床可行性和最小化脱靶毒性[1]，[16]。

在这种情况下，PFKFB4作为6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶（PFKFB）酶家族的成员，因其具有双功能催化活性而引起了相当大的兴趣，它通过调节细胞内果糖-2,6-二磷酸的水平来调控糖酵解和戊糖磷酸途径（PPP）[17]。最近的研究表明，PFKFB4在多种癌症中过度表达，突显了其在肿瘤发展中的重要作用。历史上，对PFKFB4的致癌潜力的研究主要集中在其代谢作用上，特别是其增强糖酵解通量和促进代谢重编程的能力。例如，在肝细胞癌（HCC）中，PFKFB4表达增加与肿瘤蛋白53（TP53）突变和不良临床结果密切相关，它通过代谢适应促进肿瘤进展[3]，[18]。同样，在胰腺癌中，靶向PFKFB4/GSK3β信号轴已被证明可以显著抑制糖酵解活性，从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡[19]。

然而，越来越多的文献现在强调了代谢酶的非代谢作用的重要性，这些作用往往由它们的空间定位和翻译后修饰决定[20]。PFKFB4就是一个典型的例子，因为它的激酶活性已被证明参与了超出经典葡萄糖代谢的致癌信号通路。值得注意的是，PFKFB4已被证明可以直接与类固醇受体共激活因子-3（SRC-3）在丝氨酸857位点相互作用并使其磷酸化，从而促进乳腺癌细胞的增殖和转移[21]。同样，PFKFB4介导的类固醇受体共激活因子-2（SRC-2）在丝氨酸487位点的磷酸化已被发现可以增强共激活因子相关精氨酸甲基转移酶1（CARM1）的表达，这有助于肺腺癌的恶性表型[22]。这些发现强调了在癌症生物学背景下完全解释PFKFB4的代谢和非代谢功能的重要性，这可能会产生新的机制并确定可治疗的目标。

热休克蛋白β-1（HSPB1）是小热休克蛋白（HSPB）家族中的一个特征明确的成员，具有多种细胞保护功能，包括在氧化应激期间的抗氧化特性和在暴露于各种化学应力源时的抗凋亡效应[23]，[24]，[25]。在本研究中，我们发现PFKFB4表达升高与胃癌的恶性表型之间存在强烈关联。从机制上讲，我们的数据表明PFKFB4与HSPB1物理相互作用，并通过其内在的激酶和磷酸酶活性促进HSPB1的磷酸化。这种翻译后修饰功能上抑制了胃癌细胞中的铁死亡，从而促进了肿瘤进展。

重要的是，使用5MPN这种选择性的小分子抑制剂来药理学抑制PFKFB4至关重要[26]，这导致PFKFB4表达显著下调，进而增强了铁死亡细胞死亡并显著抑制了实验模型中的胃癌进展。这些结果揭示了一个新的调控途径，即PFKFB4通过磷酸化HSPB1来抑制铁死亡，并强调了靶向PFKFB4作为增强铁死亡和改善胃癌临床结果的合理策略的治疗潜力。

部分摘录

细胞培养

正常的胃上皮细胞系GES-1以及人类胃癌细胞系AGS、SGC-7901、HGC-27、MGC-803和MKN-45均来自Genechem（中国上海）。在使用前通过短串联重复（STR）分析验证了细胞系的身份。所有细胞都在含有10%胎牛血清（Clark Bioscience，美国；目录号FB25015）和1%青霉素-链霉素溶液（HyClone，美国；目录号）的RPMI-1640培养基（Corning，美国；目录号10–040-CVR）中培养。

PFKFB4在胃癌中高度表达且与不良预后相关

为了描绘胃癌中PFKFB4的转录和翻译图谱，我们利用公开的可转录组数据集并在我们的系统中进行了实验验证。对TCGA的RNA测序数据进行分析后发现，与匹配的相邻非肿瘤性胃组织相比，原发性胃癌标本中的PFKFB4转录本显著上调（图1A）。相应地，定量实时PCR分析也证实了这一结果。

讨论

在这项研究中，我们阐明了PFKFB4在调节胃癌细胞中铁死亡中的功能作用。我们的发现表明，PFKFB4在胃癌组织和细胞系中显著上调。功能测定显示，沉默PFKFB4显著抑制了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而异位过表达PFKFB4则增强了这些恶性表型。从机制上讲，我们确定PFKFB4通过

未引用的参考文献

[47]。

CRediT作者贡献声明

马梦迪：撰写——原始草案、方法学、研究、概念化。徐欣：研究、资金获取。于可迅：方法学、正式分析。杨雄伟：软件。强卫东：可视化。达尔·埃姆雷：资源。张永红：方法学。朱江润：正式分析。孙若川：方法学。张尚鑫：验证。李永祥：撰写——审阅与编辑、项目管理、资金获取。

资助

该项目得到了国家自然科学基金青年科学基金（编号82403054）、国家自然科学基金（编号82372646）和安徽宏德善医临床研究发展专项基金（编号294126）的支持。

利益冲突声明

作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：李永祥报告称获得了国家自然科学基金的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢BioGDP（BioGDP.com）创建了图形摘要[47]。