《Biochemical Pharmacology》：Structural and molecular characterization of a small-molecule TNF-α–TNFR1 inhibitor modulating cell death signaling
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本研究通过结构虚拟筛选发现新型小分子抑制剂TI-16，可特异性阻断TNF-α/TNFR1相互作用，抑制凋亡和坏死通路，减少炎症因子释放，为开发口服TNF-α靶向药物提供新思路。
Hana Seo|Muhammad Haseeb|Sangdun Choi
韩国水原市安东大学分子科学与技术系，邮编16499
摘要
肿瘤坏死因子α（TNF-α）是炎症和自身免疫的核心介质，其凋亡和坏死凋亡通路的失调激活会导致组织损伤逐渐加重。尽管针对TNF-α的单克隆抗体疗法已显示出临床疗效，但由于给药方式、免疫原性以及下游信号传导未能完全抑制等问题，仍需探索替代治疗方法。尽管TNF-α在慢性炎症中起着关键作用，但目前尚无小分子抑制剂获得临床批准，仅有少数候选药物正在进行临床研究。本文报道了一种新型小分子抑制剂TI-16的发现及其作用机制，该抑制剂通过基于结构的虚拟筛选发现，并通过生物物理和细胞实验进行了验证。TI-16能有效保护成纤维细胞免受TNF-α诱导的凋亡和坏死凋亡，并减少促炎细胞因子的释放。利用免疫印迹、表面等离子体共振和分子动力学模拟进行的机制分析表明，TI-16选择性地破坏了肿瘤坏死因子α与肿瘤坏死因子受体1（TNF-α/TNFR1）的相互作用，而不影响TNF-α的三聚体化。通过同时抑制凋亡和坏死凋亡信号通路，TI-16克服了现有生物制剂的局限性，为开发新型口服TNF-α靶向治疗药物提供了有希望的候选分子。
引言
肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种在免疫调节中起关键作用的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和单核细胞表达。TNF-α通过三个单体结合形成三聚体结构，与两种不同的受体——肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）结合，从而介导多种生理功能[1]。TNFR1含有一个胞质死亡结构域（DD），该结构域促进与TNF-α的分子相互作用，激活导致细胞死亡（尤其是凋亡和坏死凋亡）的细胞内信号通路[2],[3]。这些过程是炎症性疾病、自身免疫性疾病及癌症的病理机制的重要组成部分，因此TNFR1成为治疗干预的理想靶点[4]。TNF-α在病理和生理过程中的双重作用凸显了其临床重要性，促使人们投入大量精力开发针对其信号通路的治疗药物[5],[6]。TNF-α的信号传导通过核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路实现，这些通路将信号传递给下游效应器。这一信号级联最终诱导促炎介质（如白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和C-X-C基序趋化因子配体1（CXCL1）的表达，同时激活凋亡和坏死凋亡等细胞死亡通路[7]。
目前已获批准的抗体药物，包括FDA批准的依那西普（etanercept）、英夫利昔单抗（infliximab）和阿达利姆单抗（adalimumab），在治疗克罗恩病、类风湿性关节炎和银屑病等自身免疫性和炎症性疾病方面显示出临床疗效[8],[9]。然而，这些生物制剂存在生产成本高、可能引发免疫反应、需通过注射给药以及因免疫抑制作用增加感染风险等局限性[10]。为应对这些挑战，研究人员正在探索多种替代方法，例如UCB-9260（通过稳定TNF三聚体核心来阻止其与TNFR1结合）和SPD304（通过破坏TNF三聚体使其解聚以干扰受体相互作用）[11],[12]。尽管取得了进展，但由于TNF-α与受体结合属于蛋白质-蛋白质相互作用，且三聚体结构中缺乏明确的结合位点，小分子TNF-α抑制剂的发展仍然面临挑战[13],[14]。基于结构的药物设计和计算筛选方法的最新进展极大地推动了这一领域的发展，使得能够发现具有更高特异性和更低脱靶效应的新化合物[15]。TNF-α的高分辨率晶体结构（特别是UCB-9260复合物，PDB ID：6OP0）揭示了关键的结合位点特征[11]。结合位点在单体界面处形成一个疏水腔，其中的Tyr59、Leu57和Tyr119等残基决定了配体的识别和亲和力[11]。这些结构信息有助于通过虚拟筛选从大型化学库中筛选出类似药物的抑制剂[16]。
鉴于TNF-α在诱导细胞死亡和促炎细胞因子表达中的关键作用[17]，我们假设靶向的小分子抑制剂能够有效抑制TNF-α信号通路，为治疗慢性免疫相关疾病提供有前景的策略[18]。在本研究中，我们采用基于结构的虚拟筛选方法识别能够干扰TNF-α-TNFR1信号通路的小分子，旨在实现有效的细胞死亡通路调节并保持良好的安全性。通过全面的体外验证，评估了这些化合物抑制TNF-α诱导的坏死凋亡和凋亡的能力以及其抑制炎症细胞因子表达的效果。结果表明，所选化合物能够破坏TNF-α-TNFR1相互作用，从而阻断下游信号级联。这些发现揭示了TNF-α抑制的关键分子机制，并解决了现有方法的局限性，为未来的药物开发提供了宝贵指导。
实验方法片段
细胞培养
HT-29和SH-SY5Y细胞从韩国细胞系库（KCLB，首尔）获得，L929和THP-1细胞系从美国ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）购买。L929细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；商品编号26140079，Gibco，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）和1%青霉素/链霉素（商品编号SV30010，Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，犹他州洛根）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。基于结构的虚拟筛选
为了发现新的TNF-α抑制剂，我们利用人类TNF-α的晶体结构（PDB ID：6OP0）[11]进行了基于结构的虚拟筛选。通过基于指纹相似性的搜索方法，从包含约2900万种化合物的化学库中筛选出可能与UCB-9260结合的化合物（图1）。
根据对接得分和先前报道的类似支架的存在情况，从这些化合物中筛选出约200个排名靠前的候选分子。
讨论
肿瘤坏死因子α（TNF-α）通过诱导促炎信号级联反应在炎症过程中起关键作用，从而导致组织损伤和慢性疾病的发展[9],[41],[42]。现有的TNF-α抑制剂存在成本高、免疫原性强以及需通过注射给药等缺点，因此亟需开发口服生物可利用的小分子替代品[44]。
通过基于结构的药物发现方法，本研究成功识别出...
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作者贡献声明
Hana Seo：负责撰写初稿、数据可视化、结果验证、方法设计、实验实施、数据分析、概念构建。
Muhammad Haseeb：负责撰写初稿、数据可视化、结果验证、软件应用、方法设计、实验实施、数据分析、概念构建。
Sangdun Choi：负责项目监督、软件选择、资源调配和项目资金筹措。
资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（National Research Foundation of Korea）的资助，项目编号分别为2022M3A9G1014520和2023R1A2C2003034。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
