肠道微生物群产生的异黄酮醇代谢物8-戊烯基萘林苷，通过G蛋白偶联的雌激素受体介导的eNOS（一氧化氮合成酶）激活作用，缓解由血管紧张素II引起的高血压中的内皮功能障碍

《Biochemical Pharmacology》：Gut microbiota-derived isoxanthohumol metabolite, 8-prenylnaringenin, mitigates endothelial dysfunction in Angiotensin II-induced hypertension through G protein-coupled estrogen receptor-mediated eNOS activation

本研究探讨8-预酶基aringenin（8-PN）对内皮功能和血管功能的影响，通过体外内皮细胞实验、离体动脉制备和Ang II诱导的小鼠模型验证。结果显示，8-PN通过激活G蛋白偶联雌激素受体（GPER）介导的Ca2+依赖信号通路，增强eNOS Ser1177磷酸化及NO生物利用度，同时激活AMPK和PI3K/Akt/ERK通路，改善血管舒张功能。分子对接证实8-PN与GPER结合能力，提示其可能作为治疗内皮功能障碍相关心血管疾病的候选药物。

　　

李承妍|安·蒂·吴·布伊|图耶特·甘·泰|李基浩|金敏秀|金秀妍|孟正焕|郑在庆|李穆耀|李尚基|尹辉烨|金南斗|韩恩熙|郑惠光

韩国大田忠南国立大学药学院，邮编34134

摘要

啤酒花（Humulus lupulus L.）传统上用于酿造，是一种富含戊二烯基黄酮的植物资源，这些黄酮具有潜在的心血管保护作用。其中，8-戊二烯基纳林根宁（8-PN）是一种由肠道微生物群将异黄樟醇转化而来的强效植物雌激素，被认为与血管健康有关。一氧化氮（NO）由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生，对血管张力和内皮完整性具有显著影响。本研究通过体外内皮细胞实验、离体动脉制备以及体内Ang II诱导的内皮功能障碍小鼠模型，探讨了8-PN对内皮信号传导和血管功能的保护作用。在内皮细胞中，8-PN通过G蛋白偶联的雌激素受体（GPER）介导的Ca²⁺依赖性信号通路（涉及Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶β（CaMKIIβ）和AMPK激活的蛋白激酶（AMPK）的磷酸化，增强了eNOS在Ser1177位的磷酸化及NO的产生。此外，8-PN还通过GPER介导的表皮生长因子受体（EGFR）激活途径激活eNOS，c-Src促进了磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和细胞外信号相关激酶（ERK）的磷酸化。分子对接结果显示，8-PN能够与GPER结合并促进下游信号通路的激活。这两种8-PN介导的eNOS磷酸化作用均通过Gβγ亚单位实现。体内实验表明，8-PN可减轻小鼠Ang II诱导的内皮功能障碍并引起血管舒张。8-PN通过两条GPER依赖性途径刺激eNOS磷酸化和NO产生，显示出其作为治疗内皮功能障碍相关血管疾病的潜在疗效。

引言

心血管疾病，尤其是高血压，是全球主要的死亡原因。证据表明，血管内皮功能障碍是高血压发病机制的关键因素[1]、[2]。在正常情况下，一氧化氮（NO）主要由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生，并参与内皮功能障碍。eNOS的活性负责血管中的NO生成，从而调节血管张力、血管平滑肌细胞增殖和体内平衡[3]。

利用天然化合物提高NO的生物利用度是治疗心血管疾病的潜在策略[4]。8-戊二烯基纳林根宁（8-PN）是一种主要存在于啤酒花（Humulus lupulus L.）中的植物来源戊二烯基黄酮。8-PN在肠道中通过微生物对异黄樟醇的O-去甲基化作用形成，这是一种丰富的啤酒花来源戊二烯基黄酮，因此是一种易于获得的微生物代谢产物[5]。8-PN通过雌激素受体表现出强效的雌激素活性[6]，是目前发现的最活跃的植物雌激素，其作为雌激素受体α的激动剂活性明显高于雌激素受体β[7]。除了雌激素活性外，8-PN还具有多种生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗癌和心脏保护作用[8]。8-PN的给药可促进新血管生成[9]。每日给予8-PN（1 mg/kg体重）可通过调节血管生成过程和代谢功能来减轻高脂饮食引起的肥胖和糖尿病[10]。尽管8-PN最著名的作用是其植物雌激素活性，但有证据表明它也可能调节内皮信号通路，从而改善血管功能[11]。然而，8-PN对内皮功能影响的分子机制尚未完全阐明。

血管紧张素II（Ang II）是肾素-血管紧张素系统的主要效应物，通过促进氧化应激和抑制eNOS活性，在高血压的发展中起重要作用，最终导致内皮功能障碍和血管病变[12]。Ang II异常激活表皮生长因子受体（EGFR），加剧血管损伤[13]。长期暴露于Ang II会通过增加氧化应激和降低NO生物利用度导致内皮功能障碍，进而增加血管阻力并引发高血压。通过增强NO介导的信号传导来恢复血管收缩与舒张之间的平衡是治疗心血管疾病的关键。在这方面，最新研究表明G蛋白偶联的雌激素受体（GPER）参与了调节eNOS活性和恢复NO生成及血管功能的非基因组信号通路[14]、[15]。据报道，GPER的激活可触发下游信号通路，包括通过Gβγ亚单位激活EGFR[16]。EGFR的激活通过c-Src的磷酸化实现。一旦被激活，EGFR可通过MAPKs和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AMPK）通路激活ERK[17]。这一级联反应导致eNOS在Ser1177位磷酸化，这是增强eNOS酶活性的关键翻译后修饰，促进NO的产生。在离体灌注的大鼠心脏中，其选择性配体G-1激活GPER可经由ERK和eNOS信号通路引起负性肌力反应[18]。同时，GPER激活会导致细胞内Ca²⁺短暂升高，进而激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶β（CaMKIIβ），进而磷酸化并激活AMPK。AMPK直接在Ser1177位磷酸化eNOS，并通过Krüppel样因子2（KLF2）和心肌增强因子2C（MEF2C）促进eNOS的转录上调[19]。

鉴于8-PN的结构特性及其激活多种血管保护通路的潜力，我们假设它可以在病理条件下恢复内皮功能并增强血管舒张。本研究通过体外内皮细胞实验、离体动脉制备以及体内Ang II诱导的内皮功能障碍小鼠模型，探讨了8-PN对内皮信号传导和血管功能的保护作用。具体而言，我们旨在确定8-PN是否通过GPER触发快速的非基因组信号传导来增强血管舒张。本研究阐明了8-PN发挥心血管保护作用的分子和功能机制。

化学试剂

Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（目录号#SH30243.01）、胎牛血清（FBS）（目录号#SH30919.03）和胰蛋白酶（Cat#SV30209.01）购自HyClone（美国犹他州洛根）。4,5-二氨基荧光素二乙酸酯（DAF-2 DA）（目录号#D23842）购自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。8-戊二烯基纳林根宁（8-PN）（目录号#P3496）（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并在-20°C下保存备用。L-NAME（目录号#483125）、LY294002（目录号#440206-5MGCN）、PD98059

8-PN通过刺激eNOS的磷酸化增强NO的产生

图1A显示了8-PN的化学结构。使用MTT和LDH实验评估了8-PN对EA.hy926细胞的细胞毒性。结果表明，浓度高达1 μM的8-PN均未表现出细胞毒性（图1B）。基于这些结果，选择0.1–1 μM的浓度用于后续实验。通过检测eNOS在Ser1177位的磷酸化情况，研究了8-PN是否调节eNOS的激活。Western blot分析显示，8-PN处理增加了eNOS的磷酸化

讨论

黄酮广泛存在于日常食用的食物和饮料中，因其健康促进作用而受到重视。在这些黄酮中，8-PN主要通过微生物对戊二烯基黄酮前体（如异黄樟醇）的生物转化在肠道中生成。8-PN被归类为植物雌激素，因为它能够与雌激素受体结合，类似于大豆异黄酮。8-PN的抗癌作用已被广泛研究；研究表明它可以抑制肿瘤细胞生长

CRediT作者贡献声明

李承妍：资源准备、方法设计、实验实施、数据分析、数据整理。安·蒂·吴·布伊：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证。图耶特·甘·泰：初稿撰写、实验实施、数据分析。李基浩：结果验证、方法设计。金敏秀：实验实施。金秀妍：实验实施。孟正焕：实验实施。郑在庆：资源准备。李穆耀：撰写——审稿与编辑、结果验证。李尚基：

资助

本研究得到了韩国政府（MSIT）资助的韩国国家研究基金会（NRF）（项目编号：RS-2024-00353812和RS-2022-NR070856）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究结果。