利用生物信息学和生物学实验识别与血管性痴呆相关的内质网应激关键基因

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Identifying endoplasmic reticulum stress-related key genes of vascular dementia using bioinformatics and biological experiments

本研究通过生物信息学及机器学习技术分析血管性痴呆（VaD）中差异表达的ERS相关基因，筛选出PPARGC1A和SEC61G作为关键诊断标志物，并在小鼠模型中验证其表达变化，为VaD的诊断和治疗提供新思路。

　　

赵一龙|邢文|姜玲玲|刘向荣|曲慧|陈伟琦|王一龙

中国北京首都医科大学天坛医院神经内科

摘要

血管性痴呆（VaD）是第二常见的痴呆类型，但其发病机制尚未完全明了，有效的诊断和治疗方法也缺乏。内质网应激（ERS）与VaD相关，并被认为是一个有前景的治疗靶点，但其确切机制仍不清楚。本研究分析了VaD中差异表达的ERS相关基因，以识别潜在的诊断标志物，并为进一步深入研究ERS在VaD中的作用提供新的视角。我们从GEO数据库中获取了人类患者的VaD基因表达数据（GSE186798）进行分析。通过将这些基因与GeneCards和Molecular Signatures Databases（MSigDB）中的基因进行交叉比对，利用生物信息学和机器学习技术识别出与VaD诊断相关的关键ERS相关基因。两个关键基因——过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1-α（PPARGC1A）和SEC61转运蛋白亚基γ（SEC61G）显示出良好的VaD诊断能力，并通过接收者操作特征（ROC）曲线分析在GSE122063数据集中得到了验证。GeneMANIA分析表明VaD病理生理与ERS反应之间存在密切关联。计算预测了受microRNAs、转录因子和化学物质调控的枢纽基因，同时也观察到了免疫细胞的异常调节。在体内双侧颈动脉狭窄（BCAS）小鼠模型中，定量实时PCR（qRT-PCR）和Western blotting分析证实了这些枢纽基因表达水平的显著下调。这些枢纽基因可能作为VaD的潜在诊断生物标志物。

引言

血管性痴呆（VaD）是一种与年龄相关的神经系统疾病，其认知缺陷归因于血管病变，如缺血性中风、出血性中风、脑缺血或缺氧[1]。它是仅次于阿尔茨海默病（AD）的第二大常见痴呆原因，占所有痴呆病例的至少20%，在中国和其他亚洲国家中发病率很高[2]。VaD有许多相关风险因素，包括不良饮食、肥胖、高血压、高胆固醇血症、长期大量饮酒、糖尿病、吸烟、缺乏运动和空气污染[3]。根据影像学和病理变化，VaD可分为多种亚型，包括多梗死性痴呆、小血管性痴呆、战略性梗死性痴呆、低灌注性痴呆、出血性痴呆、遗传性VaD以及伴有心血管疾病的AD[4]。VaD的平均发病年龄、诊断年龄和死亡年龄分别为67.5±7.2岁、73.5±7.0岁和77.0±6.9岁。与其他类型的痴呆相比，VaD患者的生存时间较短[5]。目前，VaD的诊断主要依赖于临床信息和神经影像学检查。然而，这些方法的敏感性和特异性低于分子生物标志物所能达到的水平[6]。此外，目前还没有有效的药物可以治疗或预防VaD[7]。因此，迫切需要更有效的VaD诊断和治疗方法。

最近的研究强调了内质网应激（ERS）在VaD进展中的重要性，表明它可能是未来治疗的分子靶点。内质网（ER）是一个关键细胞器，在蛋白质折叠、钙储存和脂质合成中起着重要作用[8]。当ER因错误折叠或未折叠蛋白质的积累而“受压”时，细胞会启动未折叠蛋白质反应（UPR，也称为ER应激反应），从而快速重新编程分子伴侣蛋白和折叠酶基因的表达，增强ER的蛋白质折叠能力[9]。UPR通过三条主要途径介导：依赖肌醇的酶1（IRE1）途径，通过X-box结合蛋白1（XBP1）mRNA剪接增强ER降解错误折叠蛋白质的能力；ATF6途径，在ERS响应下转移到高尔基体并发生切割，从而增强与UPR相关的基因表达；以及PKR样ER激酶（PERK）途径，它磷酸化真核起始因子2α（eIF2α），从而减少蛋白质合成并减轻ER负担，同时激活应激反应基因[10]。这些途径通过最小化蛋白质错误折叠、改善蛋白质正确折叠和促进错误折叠蛋白质的降解来恢复ER的功能。如果平衡被破坏，长期的ERS可能导致细胞损伤和凋亡[11]。

多项研究表明ERS在VaD中起作用。例如，一项研究发现桃红四物汤通过抑制ERS和细胞凋亡对VaD大鼠的认知缺陷有积极作用[12]。此外，褪黑素也被发现可以通过抑制ERS改善VaD大鼠的认知功能[13]。其他研究发现Gardenia jasminoides提取物GJ-4可以通过PERK介导的ERS途径减少VaD大鼠的记忆缺陷[14]。这些发现表明，针对ERS途径可能为VaD的管理提供新的治疗策略。然而，ERS在VaD进展中的确切作用仍很大程度上未知。进一步研究ERS在VaD中的作用及其分子机制可能为VaD的诊断标准和治疗靶点提供新的见解。

生物信息学结合了计算机科学、数学、统计学和信息工程的方法和工具，用于探索疾病机制并促进药物开发[15]。通过分析基因表达数据，生物信息学可以识别与疾病相关的基因。以往的研究主要使用生物信息学分析来研究AD的病理生理过程[16,17]。然而，尚未有研究利用这些方法来探讨ERS相关基因在VaD中的作用。本研究的主要目标是利用先进的生物信息学分析和机器学习技术，阐明ERS与VaD之间的分子机制。通过确定枢纽基因并了解其功能意义，我们旨在改进VaD的诊断和治疗策略。

部分片段

微阵列数据来源

与VaD相关的微阵列谱型是从GEO数据库中筛选和检索的（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。GSE186798数据集是利用GPL23159平台生成的，包括每个类别的十个样本（健康对照组、中风后非痴呆组、中风后痴呆组）[18]。我们仅选择了中风后痴呆患者（VaD组）和健康对照组（对照组）的样本。组织样本取自大脑的前额区域。GSE122063

差异表达分析和GSEA分析

图1展示了研究流程图。比较VaD和对照组样本后，发现了323个差异表达基因（DEGs），其中138个基因表达上调，185个基因表达下调（图2A）。热图显示了VaD组和对照组之间的差异基因表达（图2B）。此外，GSEA确认ERS相关基因集在我们的显著DEGs列表中富集。分析显示VaD组中ERS相关通路受到显著抑制，例如“插入”通路

讨论

VaD是一种伴有临床中风或亚临床血管脑损伤的综合征，对认知功能有不良影响[43]。VaD的发病机制尚未完全阐明，目前也没有明确或有效的治疗策略[44]。越来越多的证据支持ERS在VaD发展中的重要作用[45,46]。RNA测序结合综合生物信息学分析和机器学习技术

结论

本研究整合了生物信息学分析、两种机器学习方法和体内实验，以验证和揭示与VaD相关的ERS基因。我们的分析发现了ERS和VaD之间的16个共享基因，通过机器学习确定了两个关键基因：PPARGC1A和SEC61G。通过外部验证数据集和动物实验，我们发现PPARGC1A和SEC61G可能是VaD的潜在ERS相关诊断标志物，并为ERS在VaD中的作用提供了新的见解

CRediT作者贡献声明

赵一龙：撰写——原始草稿，正式分析，概念构思。邢文：撰写——原始草稿，验证。姜玲玲：方法学。刘向荣：可视化。曲慧：方法学。陈伟琦：撰写——审阅与编辑，监督。王一龙：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，概念构思。

伦理批准和参与同意

所有动物实验均获得了北京神经外科研究所动物护理和使用委员会的批准。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82301450、82425101）、非传染性疾病-国家科技重大专项（编号：2023ZD0504800、2023ZD0504801、2023ZD0504802、2023ZD0504803、2023ZD0504804）、北京市科学技术委员会（编号：Z231100004823036）、首都健康改善与研究基金（2022-2045）、以及中国国家重点研发计划（2024YFC3044800、2022YFF1501500、2022YFF1501501）的资助

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢Xiantao Academic Tools（https://www.xiantaozi.com）在数据分析方面的协助。