《Biomaterials》：Prolonging the Anti-Tumor Effects of Cold Atmospheric Plasma via Exosome-Mediated Signaling
编辑推荐：
本研究发现，冷大气等离子体（CAP）处理癌细胞产生的外泌体（CAP-Exo）能有效传递凋亡信号，增强CAP对白血病和实体瘤的抗癌效果，克服穿透深度限制，减少系统性毒性。
李文|曹莉|朱家琪|王慧|刘一杰|张凌宇|郭晨|严静|王文静|周波|连江芳|郭波|黄晨
中国西安交通大学健康科学中心基础医学科学学院细胞生物学与遗传学系
摘要
冷大气等离子体（CAP）作为一种非热疗方式，在癌症研究中展现出巨大潜力，因为它能够通过活性氧和氮物种诱导选择性细胞毒性。然而，等离子体产生的活性物种在复杂生物环境中的渗透深度有限且不稳定，这成为其临床应用的主要障碍。在本研究中，我们探讨了从CAP处理的癌细胞中提取的外泌体（CAP-Exo）是否可以作为功能性介质，来增强和扩展CAP的抗肿瘤效果。以慢性髓性白血病K562细胞为主要模型，我们发现CAP处理能够显著诱导氧化应激、细胞凋亡和持续的增殖抑制。重要的是，与未处理的对照组相比，从CAP处理的细胞中分离出的外泌体在受体细胞中表现出更强的抗增殖和促凋亡活性。为了评估这一策略的广泛应用性，我们进一步在多种实体瘤模型（包括乳腺癌、肾癌和肝细胞癌）中评估了CAP和CAP-Exo的效果，这些实验既在体外也在体内进行。CAP处理一致降低了各种实体瘤细胞的存活率，而CAP-Exo对乳腺癌细胞仍具有强烈的细胞毒性，并且在相应的异种移植模型中显著抑制了肿瘤生长，且没有引起全身毒性。从机制上讲，CAP诱导的应激重新编程了外泌体的负载物质，使其能够将与死亡相关的分子信号传递给受体肿瘤细胞，从而促进细胞凋亡。总体而言，我们的研究结果表明，CAP修饰的外泌体是一种生物活性强的无细胞方法，能够扩展CAP治疗在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中的抗肿瘤效果。CAP-Exo可以作为补充策略，增强基于CAP的癌症干预措施，并克服直接应用CAP时存在的局限性。
引言
冷大气等离子体（CAP）作为一种有前景且非传统的生物医学工具而受到关注，主要是因为它可以在接近室温的条件下运行。这一特性使其能够与生物组织直接进行非热相互作用，引发多种生理效应，这些效应目前正在积极探索其临床应用[1]。其中，CAP作为新型肿瘤治疗方式的潜力尤其受到关注，既可以单独使用，也可以作为现有策略的补充[2]、[3]。CAP主要通过生成活性氧和氮物种（RONS）来发挥其生物学效应，包括过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2-）、亚硝酸盐（NO2-）、羟基自由基（OH•）和一氧化氮（NO）。这些物种可以通过气体和液体相传递，并且重要的是，它们对癌细胞具有选择性细胞毒性，同时对健康组织的损伤较小[4]、[5]。
尽管具有这些优势，CAP的临床应用仍受到其有限的组织渗透深度的限制。实证和计算研究表明，等离子体产生的活性物种的有效范围仅约为1.0–1.5毫米[6]、[7]。为了解决这一挑战，提出了等离子体激活溶液（PAS），通常由预先用CAP处理的盐水、缓冲系统或油组成，以保留活性物种。PAS可以直接应用于肿瘤部位，并在临床前模型中显示出治疗潜力[8]、[9]、[10]。然而，在晚期恶性肿瘤中，尤其是当肿瘤位于组织深处或通过转移和循环肿瘤细胞扩散时，其效果仍然有限。此外，PAS中的活性物种容易被血液和肿瘤微环境中的内源性抗氧化剂中和，进一步降低了其治疗效果[11]。因此，需要创新的递送策略来扩展CAP的治疗范围，使其能够覆盖超出表层肿瘤区域。
外泌体——直径在30到150纳米之间的纳米级细胞外囊泡——在这种情况下是一个有吸引力的替代方案。外泌体广泛分布于血液和尿液等生物流体中，通过将蛋白质、脂质和核酸等多种生物分子从供体细胞传递到受体细胞来介导细胞间通讯[12]、[13]。来自肿瘤或干细胞的外泌体已被证实参与了关键的病理过程，包括血管生成、侵袭和转移[14]、[15]。在其功能性负载物质中，肿瘤抑制蛋白（如PTEN）在传递到靶细胞后能够保持酶活性并调节致癌信号通路，从而抑制肿瘤增殖[16]。越来越多的证据还强调了微小RNA（miRNAs）在外泌体介导的信号传导中的核心作用[17]。例如，来自乳腺癌细胞的外泌体富含miR-21，可以被破骨细胞前体内化，通过上调NFATc1和下调PDCD4来促进骨溶解[18]、[19]、[20]。同样，含有miR-19a的外泌体已被报道可以抑制PTEN并激活NF-κB和AKT通路，促进破骨细胞分化并促进骨转移[21]、[22]。新兴研究还表明，外泌体有助于化学抗性；从药物处理的乳腺癌细胞释放的外泌体携带miR-9-5p、miR-159-5p、miR-203a-3p和annexin A6，这些物质可以抑制肿瘤抑制因子的表达并干扰EGFR的降解，从而使细胞对先前敏感的药物产生抗性[23]、[24]。除了这些病理作用外，外泌体作为治疗载体还具有内在优势，包括出色的生物相容性、低免疫原性、在循环中的高稳定性以及穿越生物屏障的能力[25]。鉴于外泌体反映了其供体细胞的生理状态，我们假设从CAP诱导的凋亡癌细胞中提取的外泌体（CAP-Exo）可能包裹与凋亡相关的分子信号，并将其传递给邻近或远处的恶性细胞。通过这种间接的囊泡途径，CAP-Exo可能增强CAP的治疗效果，并将其影响范围扩展到直接CAP暴露之外的区域（图1）。
在我们之前的工作中，我们开发了一种基于氩氧喷射配置的Tri-CAP系统，该系统在实现对慢性髓性白血病（CML）细胞的高选择性同时，产生的活性氧物种水平相对较低。机制研究表明，Tri-CAP在体外和体内模型中都能调节细胞内的氧化还原平衡、糖酵解代谢和HIF-1α通路[5]。基于这些发现，本研究采用CML作为主要疾病模型，探索了一种基于外泌体的策略。从CAP处理的癌细胞培养基中分离出的外泌体被定义为CAP-Exo，并进行了系统的表征。荧光标记和功能测定证实了它们对恶性细胞的细胞毒性作用，而小RNA测序显示了一组特定的与凋亡相关的miRNAs富集。总体而言，这些结果表明CAP-Exo可以作为CAP诱导的细胞毒性信号的稳定和生物活性载体，为CAP喷射或PAS提供了一种补充方法。这项工作旨在建立一个概念框架，将CAP的局部物理化学效应转化为更广泛的生物学结果，从而弥合CAP的空间限制与晚期恶性肿瘤的系统性质之间的差距。
部分内容摘录
细胞培养
人类慢性髓性白血病K562细胞、人类乳腺癌细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）、人类肾癌细胞系（Caki-1和786-O）以及人类肝细胞癌细胞系（Huh-7、MHCC97L和MHCC97H）均来自西安交通大学的生物医学实验中心。K562、Caki-1和786-O细胞在RPMI-1640培养基（Cytiva，美国马萨诸塞州）中培养，而MCF-7、MDA-MB-231、Huh-7、MHCC97L和MHCC97H细胞则在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养
等离子体喷射参数
充分了解等离子体喷射参数对于确保基于CAP的生物医学应用的可重复性、效率和安全性至关重要。在本研究中，我们使用了一种先前已被验证具有选择性抗白血病效果的氩气驱动的CAP喷射装置，并在生物学相关的操作条件下进行了全面的物理化学表征。所使用的等离子体装置采用了一种由同轴
结论
本研究提供了令人信服的证据，证明冷大气等离子体（CAP）对肿瘤细胞具有强大且选择性的细胞毒性作用，同时对正常细胞无害，并通过利用外泌体介导的信号传导，进一步解决了传统CAP应用中存在的渗透深度和活性物种不稳定性问题。我们证明，从CAP处理的肿瘤细胞中提取的外泌体（CAP-Exo）能够有效传递CAP诱导的肿瘤抑制信号
CRediT作者贡献声明
李文：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，方法学研究，实验设计，数据分析。王文静：撰写——审稿与编辑，方法学研究。严静：实验设计。连江芳：监督，资金获取。周波：方法学研究，资金获取。刘一杰：实验设计。朱家琪：验证。郭晨：实验设计。张凌宇：实验设计。郭波：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，监督，项目管理，资金管理
伦理
所有动物实验均按照西安交通大学伦理委员会批准的指南和动物协议（编号2020-214）进行。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
数据可用性
本研究生成和/或分析的数据集可根据合理请求向相应作者获取。写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT来提高手稿的可读性和语言表达。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作部分得到了国家自然科学基金（编号82500803）、中央高校基本科研业务费（编号xzy012023005）、西安交通大学第一附属医院的基金（2024-QN-22）、西安交通大学第一附属医院临床研究项目（XJTU1AF-CRF-2024-019）以及浙江省医学与健康科学技术计划（编号2025KY1276）的支持。李文在此表示感谢
