溶血磷脂酸诱导角膜基质细胞中外泌体miR-221-3p的上调，从而促进角膜内皮细胞的愈合

《Biomaterials Advances》：Lysophosphatidic acid-induced upregulation of exosomal miR-221-3p from corneal stromal cells promotes corneal endothelial healing

角膜基质细胞（CSCs）分泌的外泌体及其miRNA-221-3p通过激活Hippo/YAP通路促进角膜内皮细胞（CEnCs）增殖，LPA可增强外泌体中miR-221-3p含量并加速角膜内皮损伤修复，为细胞外囊泡疗法提供新思路。

　　

陈宏志 | 蔡宜珍 | 梅尔雅君 | 赖瑞阳 | 黄哲成 | 陆才德 | 程朝民 | 林松树 | 马维康 | 吴伟志

台湾桃园市林口分院长庚纪念医院眼科

摘要

角膜透明度的维持依赖于角膜内皮的水分泵送功能。目前，角膜移植仍是治疗角膜内皮功能障碍的唯一方法。由于全球供体角膜短缺，因此开发替代疗法至关重要。在之前的研究中，我们证实了角膜基质细胞（CSCs）的分泌可以促进角膜内皮细胞（CEnCs）的增殖。这种效应可以通过使用溶血磷脂酸（LPA）这种生物活性磷脂来增强。然而，参与CSC分泌的成分仍有待阐明。在本研究中，我们探讨了CSC来源的外泌体及其微小RNA（miRNAs）在促进CEnCs增殖和角膜内皮修复方面的治疗潜力。通过纳米粒子追踪（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和免疫测定法对CSC外泌体进行了表征。通过RNA测序鉴定出CSC外泌体中的miRNA表达谱，共发现767种不同的miRNAs。LPA能够增强CSC外泌体和miR-221-3p的增殖效应。miR-221-3p的异位表达进一步增加了CEnCs的增殖，并抑制了CDK抑制剂p27^Kip1的表达。我们使用兔眼经角膜冷冻模型评估了治疗效果，结果显示，CSC外泌体或miR-221-3p的角膜内皮注射显著改善了角膜内皮损伤，表现为角膜厚度的恢复以及角膜内皮六边形形态的重建。我们的发现表明，CSC外泌体和miR-221-3p可能是治疗角膜内皮疾病的潜在无细胞疗法，为改善角膜再生提供了创新途径。

引言

角膜是一种透明的组织，负责将光线投射到眼睛中以实现视觉感知。其光学清晰度主要依赖于角膜内皮对基质水分含量的调节。角膜内皮细胞（CEnCs）在将多余的水分从角膜基质排向前房方面起着关键作用，从而防止角膜水肿的发生[1]。目前，角膜移植是治疗角膜内皮功能障碍的唯一方法。为了开发角膜内皮疾病的治疗方法，我们研究了溶血磷脂酸（LPA）的增殖促进作用。LPA是细胞膜中的磷脂成分，它在环境刺激下通过激活磷脂酶A2和autotaxin释放出来。释放的LPA具有多种生物活性，包括刺激细胞增殖和防止细胞凋亡[2]。我们观察到LPA通过激活Hippo/YAP通路直接促进CEnCs的增殖[3]。我们还发现LPA通过诱导角膜基质细胞（CSCs）分泌白细胞介素（IL）-1β间接促进CEnCs的增殖并增加角膜上皮细胞（ECD）。然而，中和IL-1β仅部分减少了LPA处理过的CSC条件培养基（CSC-CM）的增殖效应[4]。因此，我们认为CSC-CM中存在的其他分泌因子可能促进细胞增殖，并具有临床应用潜力。

先前的研究已经证明，含有间充质干细胞（MSC）分泌物的MSC-CM能够在体外有效促进人类CEnCs的存活和增殖[5][6]。CSCs来源于前房前壁的外胚层，位于角膜基质的胶原层中。与MSC-CM相比，CSC-CM在促进人类CEnCs增殖方面表现出更强的效果[7]。此外，CSC分泌物在体外培养模型中加速了由超声乳化术引起的角膜内皮损伤的愈合[8]。CSC分泌物包含可溶性蛋白质（如细胞因子）和细胞外囊泡（EVs）[9]。在EVs中，外泌体的直径为50–150纳米，特异性生物标志物包括CD63、CD81和ALIX[10][11][12]。先前的研究已经证实局部应用CSC外泌体可以促进角膜上皮伤口的愈合[13]。然而，目前尚无研究探讨这些外泌体是否有助于角膜内皮的愈合。最近的研究越来越多地将外泌体和细胞外囊泡视为角膜修复的无细胞疗法候选者，大多数临床前证据强调它们对上皮伤口闭合和炎症或新生血管反应的调节作用，通常使用MSC来源的分泌组或EV制剂，并关注眼部递送问题[14][15]。同时，来自不同类型驻留细胞的角膜来源EVs已被证明会影响修复相关的表型和信号通路，支持EV介导的层间通讯对角膜稳态和伤口反应的贡献[16]。然而，直接针对角膜内皮修复的机制研究仍然相对有限，现有数据表明内皮EVs可以被受体CEnCs内化并产生可测量的功能效应[17]。基质细胞外泌体也表现出与疾病和功能相关的分子特征，这支持了它们在角膜重塑中的生物学相关性[18]。因此，我们关注外泌体中的miRNAs作为潜在的介质。

研究表明，外泌体作为载体可以包裹和运输微小RNA（miRNAs）[19]。miRNAs在细胞调节中发挥多种关键作用。通过旁分泌作用，外泌体miRNAs通过调节基因表达参与细胞活动的调节[20][21]。Yoon等人的研究表明，用褪黑素刺激MSCs可以增加MSC外泌体中的miR-4516水平，从而增强MSC外泌体治疗慢性肾病的效果[22]。类似地，缺氧刺激也被证明可以增加MSC外泌体中的miR-126水平，促进MSC外泌体刺激骨折愈合的能力[23]。这些发现表明，通过刺激细胞，可以增加MSC外泌体中特定miRNAs的含量，从而增强其生物学效应。关于CSC外泌体，Yam等人的研究报告称，CSCs分泌的外泌体含有miR-29a和miR-381-5p，这些miRNAs具有抗炎和抗纤维化特性，有助于防止瘢痕形成[24]。因此，我们认为CSC外泌体中的miRNAs也具有显著的治疗潜力，值得进一步研究。

在本研究中，我们探讨了CSC外泌体和miR-221-3p在治疗角膜内皮损伤方面的治疗潜力。我们的发现表明，CSC外泌体可以促进CEnCs的增殖。LPA增强了CSC外泌体的增殖效应，并增加了miR-221-3p的含量。我们还研究了CSC外泌体和miR-221-3p对角膜内皮修复的影响。这些结果表明，CSC外泌体或miR-221-3p是治疗角膜内皮疾病的潜在候选者。

材料

我们从Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）购买了Opti-minimal essential medium（Opti-MEM）、Dulbecco's modified Eagle medium（DMEM）、庆大霉素、无血清人内皮培养基（HE-SFM）、两性霉素B、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）。此外，我们还从Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买了茜素红、RPMI 1640维生素溶液和LPA。另外，我们还获得了重组人成纤维细胞生长因子-basic。

CSC来源的外泌体的增殖效应被LPA增强

与之前的研究[4]一致，我们发现共培养CSCs和CEnCs可以促进CEnCs的增殖。此外，LPA诱导了CSCs分泌IL-1β，从而增强了CSC-CM对CEnCs的增殖效应（对照组与LPA组相比的相对细胞数量：100.0%±9.6% vs 143.9%±12.2%，P<0.01）。即使添加抗体中和IL-1β的活性，CSC-CM仍表现出显著的效果，相对细胞数量为119.7%±7.3%（P<0.01，图）。

讨论

角膜内皮疾病是一个具有临床意义且具有挑战性的问题。我们之前的研究强调了LPA能够缓解对人类CEnCs有丝分裂的抑制，从而直接刺激细胞增殖[3]。我们还发现，角膜基质中的LPA可以促进CSC细胞分泌IL-1β，间接促进人类CEnCs的增殖并增加ECD（图S1）[4]。在本研究中，我们发现LPA还可以增加CSC外泌体中的miR-221-3p水平。

结论

总之，我们的研究表明，CSC外泌体可以促进CEnCs的增殖并增强角膜内皮的修复。LPA增强了CSC外泌体的增殖效应，并增加了外泌体中的miR-221-3p含量。此外，富含LPA的miR-221-3p有效促进了细胞增殖并增强了角膜内皮的修复。在临床上，CSCs可以从角膜移植后的剩余供体组织中获得，因此我们认为进行角膜基质内注射是一个可行的方法。

缩写列表

CSC
角膜基质细胞
CEnC
角膜内皮细胞
LPA
溶血磷脂酸
IL
白细胞介素
CSC-CM
CSC条件培养基
MSC
间充质干细胞
EVs
细胞外囊泡
HSP70
热休克蛋白70
miRNA
微小RNA
MEM
最小必需培养基
DMEM
Dulbecco's modified Eagle medium
无血清人内皮培养基
胎牛血清
磷酸盐缓冲盐水
EDTA
乙二胺四乙酸
b-FGF
成纤维细胞生长因子-basic
hEGF
人表皮生长因子
FNC
FNC涂层混合物
DM
Descemet膜

CRediT作者贡献声明

陈宏志：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、项目管理、研究、数据分析、概念构思。 蔡宜珍：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、研究、数据分析、概念构思。 梅尔雅君：方法学设计、研究。 赖瑞阳：方法学设计、研究。 黄哲成：方法学设计、研究。 陆才德：方法学设计、研究。 程朝民：方法学设计、研究。

出版同意

不适用。

伦理批准和参与同意

本研究遵循了《赫尔辛基宣言》的原则，并获得了台湾林口长庚纪念医院当地机构审查委员会和伦理委员会的批准。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT来简化文本并提高可读性。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

资助

本研究得到了长庚纪念医院（CRRPG3M0072、CRRPG3M0112）和台湾科技部（MOST 111-2314-B-182A-067-MY3）的资助，资助对象为陈宏志。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢长庚纪念医院林口分院的显微镜核心实验室、基因组医学核心实验室和实验动物中心提供的技术支持。