《Bioorganic Chemistry》：Design, catalyst-free synthesis, DFT study and anticancer assessment of new 2,9-disubstituted purine-6-carboxamides
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绿色无催化剂合成17种2,9-取代嘌呤-6-羧酰胺新化合物，其中6E对EGFR抑制活性最佳（IC50 4.35 μM），较伊洛替尼提高约2倍，并通过DFT和分子动力学验证其作用机制。
Joydeep Chatterjee|Shivkanya M. Bhujbal|Gaurav Joshi|Uttam Kumar Mishra|Ashoke Sharon|Muskan|Shivam Singh|Muhammad Wahajuddin|Prasad V. Bharatam|Rajdeep Dalal|Raj Kumar
旁遮普中央大学健康科学学院药学科学与天然产物系药物设计与合成实验室，印度巴廷达151401
摘要
我们成功合成了17种新的2,9-二取代嘌呤-6-羧酰胺（化合物5和6），这些化合物被设计为EGFR抑制剂，产率高达85–93%。密度泛函理论（DFT）分析表明，与其它途径相比，这些化合物形成了一个能量更优的噁唑烷环过渡态，其活化能垒更低，这解释了实验观察到的选择性。体外抗癌活性测试显示，这些化合物对A549肺癌细胞具有剂量依赖性的生长抑制作用，IC50值介于4.35至22.1 μM之间，其中化合物6E表现出最强的活性。其活性优于参考药物厄洛替尼：细胞IC50值为4.35 μM（厄洛替尼为11.83 μM），EGFR酶活性IC50值为105.96 nM（厄洛替尼为218.47 nM），表明其效力大约提高了2倍。流式细胞术分析显示，化合物6E显著降低了p-PI3K水平，与厄洛替尼相当，表明其在细胞水平上有效抑制了EGFR–AKT信号通路。机制研究表明，6E增加了活性氧（ROS）的产生，诱导了线粒体去极化，并促进了细胞凋亡。
引言
尽管21世纪医学取得了显著进步，但主要癌症类型的发病率仍在持续上升，使其成为全球主要的死亡原因之一[1][2]。癌症的多样性和遗传/病理特征使其更加可怕，因为它能够逃避凋亡，对多种治疗策略无反应，还会引发反馈循环，并出现多种耐药性问题。目前已确定癌症的14个特征，其中酪氨酸激酶被认为是增殖信号传导的调节因子[3]。迄今为止，已在人类基因组中鉴定出518个蛋白激酶基因，其中478个是经典蛋白激酶，40个是非经典蛋白激酶[4]。酪氨酸激酶，尤其是EGFR（表皮生长因子受体），不仅调控蛋白质磷酸化，还在非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌[6]、胰腺癌[7]和乳腺癌[8]等主要癌症类型中作为预后、诊断和预测生物标志物发挥作用。
几十年来，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了多种EGFR抑制剂（图1）。第一代抑制剂如厄洛替尼和吉非替尼是可逆的、ATP竞争性抑制剂，针对原发或激活突变。第二代抑制剂如阿法替尼和达科替尼是不可逆抑制剂，也针对原发突变，但以非ATP竞争性方式起作用。第三代抑制剂如奥西替尼、奥莫替尼和拉泽替尼主要是嘧啶类药物，针对T790M突变和外显子20插入（呋莫替尼）[9][10]。此外，第四代抑制剂如JND-3229（临床前阶段）、BLU-945（NCT04862780）和TQB-3804（NCT04128085）正处于临床阶段，旨在克服C797S突变[11]。所有这些抑制剂都存在一些局限性，包括获得性耐药性和一些常见的不良反应，如胃肠道、心脏和皮肤毒性[11][12]。为了克服这些挑战，研究人员经常转向类似的结构作为替代策略。基于这一方法，我们的研究小组开发了多种结构，包括嘌呤类似物，以靶向EGFR过度表达[13]。
嘌呤是一类杂环化合物，由两个环系统组成，一个是咪唑环与一个嘧啶环融合而成，是DNA、RNA和ATP的重要组成部分[14]。此外，诸如氟达拉滨（DNA稳定剂）[15]、罗斯科维汀（CDK2、CDK7、CDK9抑制剂）[16]、泽拉维斯皮布（HSP-90β抑制剂）[17][18]、法达拉西布（CDK2、CDK9抑制剂）[19][20]、利那格列汀（DPP-4抑制剂）[21]、硫唑嘌呤（类风湿性关节炎、炎症性肠病）[22]、喷昔洛韦（核苷聚合酶抑制剂）[23]等化合物，作为针对多种疾病（包括癌症）的有效治疗剂（图2A）。另一方面，酰胺在药物化学中具有重要意义，约25%的获批药物中含有酰胺[24]。由于其改善的药代动力学（亲水-疏水平衡、代谢稳定性、生物利用度）和药效学（氢键供体-受体性质）特性，酰胺成为重要的生物等效修饰方式[25][26]。特别是含有羧酰胺的药物，如扎努布替尼（布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂）[27]、吉列替尼（FMS样酪氨酸激酶3抑制剂）[28]、尼拉帕利（PARP-1和PARP-2抑制剂）[29]等，被用于多种抗癌治疗（图2B）。
最近，我们的研究小组专注于开发新型抗癌剂[30][31]，利用咪唑融合结构作为EGFR抑制剂[33][34][35]。在其中一项研究中，我们合成了四种嘌呤-6-羧酰胺衍生物作为潜在的EGFR抑制剂[13]，用于治疗肺癌，保持9位上的4-氟苯基取代基不变，仅改变2位的取代基（方案1a）。其中，两种含有3,4-甲氧基苯基和4-异丙基苯基取代基的化合物对野生型EGFR表现出较强的活性，IC50值分别为617.33 nM和710 nM[13]。
为了进一步开发结构-活性关系（SAR）并发现更好的候选化合物，我们考虑改变嘌呤骨架2位和9位的取代基，以设计目标化合物5和6（图3），从而生成一系列化合物（图3）。值得注意的是，代表性化合物6E（绿色骨架）在EGFR的ATP结合位点（PDB ID：4HJO）的初步对接结果显示，它与关键氨基酸残基（如Met769、Leu768和Gln767）发生了相互作用，这与厄洛替尼（天蓝色骨架）观察到的相互作用相似。这些发现表明，设计的化合物能够有效占据EGFR的催化区域（TQLMP基序）（图3）[36]。
目前用于合成2,9-二取代嘌呤-6-羧酰胺类似物的方法包括使用各种前体，在碱性（TEA）或酸性（H2SO4）条件下与适当的醛类发生环缩合。例如，过程‘a’（方案1a）包括在室温下，5-氨基-1-(4-氟苯基)-1H-咪唑-4-碳酰亚胺氰化物（A）与不同醛类在甲醇中在H2SO4的作用下发生环缩合，仅得到四种产物[13]。而在另外两种过程中，N-取代的4-氨基-3,4-二氰丁-3-烯酰胺（B）或取代的5-氨基-1H-咪唑-4-碳酰亚胺氰化物（C）分别与各种醛类在I2和TEA的催化作用下在甲醇中发生环缩合（5/6，方案1b）[37]，或在DMSO中使用TEA发生环缩合（5/6，方案1c）[38][39][40]。
所有这些方法都存在一些局限性，包括使用各种酸性或碱性催化剂[13][37][38][39]、产率较低或反应时间较长。考虑到绿色化学在药物化合物合成中的作用[40]，我们设想开发一种环境友好的方法，在室温下无催化剂条件下以更高的产率合成目标化合物5和6（方案1d）。
在本研究中，我们实现了17种新的2,9-二取代嘌呤-6-羧酰胺衍生物的无催化剂合成，通过密度泛函理论（DFT）计算预测了反应机制，并通过EGFR抑制作用评估了它们的抗癌活性，随后通过分子动力学模拟了解了EGFR-化合物复合物的稳定性。
合成方法
首先，我们合成了关键中间体4A-4C；二氨基马来腈（1）与三乙基原甲酸酯（CH(OEt)3）在1,4-二氧环烷中缩合，生成相应的亚胺酯（2）。然后，该亚胺酯与各种取代苯胺发生取代反应，形成相应的亚胺酰胺（3A-3C）。接着，在1,8-二氮杂环[5.4.0]十一烯（DBU）的作用下，这些亚胺酰胺在甲醇中发生碱催化环化，生成最终产物
结论
本研究通过实验和计算相结合的方法，对17种新的2,9-二取代嘌呤-6-羧酰胺作为EGFR抑制剂进行了设计、无催化剂合成和抗癌活性评估。通过DFT分析和实验验证，我们证实了新型噁唑烷环过渡态的可行性，以及甲醇分子在促进质子转移中的作用，为这些化合物的合成提供了可持续的途径
一般信息
实验使用了标准实验室设备，包括称重天平（Mettler Toledo）、加热套、数字加热板（IKA）、旋转蒸发器（IKA）和真空烤箱。所有化学品和溶剂均从Sigma Aldrich、TCI Chemicals、GLR Innovations和Rankem等商业来源购买。质谱（HRMS）和核磁共振（1H, 13C）数据在旁遮普中央大学的Agilent QTOF-6530 LC/MS和JEOL NMR光谱仪（600 MHz）上记录。
作者贡献声明
Joydeep Chatterjee：撰写原始草稿、方法学设计、数据分析。
Shivkanya M. Bhujbal：撰写原始草稿、软件开发、方法学设计、数据分析。
Gaurav Joshi：数据分析、方法学设计。
Uttam Kumar Mishra：数据分析、方法学设计。
Ashoke Sharon：数据分析、方法学设计。
Muskan：撰写原始草稿、方法学设计、数据分析。
Shivam Singh：数据分析、方法学设计、软件开发。
Muhammad Wahajuddin：数据验证、监督工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
RK和JC感谢CSIR-EMR-II（02(0397)/21/EMR-II）资助这项工作并提供研究经费。所有作者感谢各自机构提供的必要基础设施和支持。JC和RK感谢DST-PURSE(SR/PURSE/2023/220(C)、ANRF-SERB CRG/2023/000749和DST-FIST（旁遮普中央大学化学系）提供的HRMS分析支持，以及CIL（CU Punjab）提供的样品分析支持。作者还感谢
