《Biophysical Chemistry》：High-resolution AFM imaging of the CA125 protein and its aptamer-based complexes
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本研究提出基于高分辨率原子力显微镜（AFM）成像数据评估aptamer/抗原复合物形成效率的方法，通过分析吸附在新鲜解理云母表面蛋白及复合物的形貌高度与体积，揭示aptamer_1与两种CA125蛋白片段形成复合物，而aptamer_2未形成有效结合，验证了AFM单分子检测技术的适用性及超尖锐探针在提高分辨率中的作用。
M.O. Ershova|A.A. Valueva|T.O. Pleshakova
生物医学化学研究所（IBMC），俄罗斯莫斯科Pogodinskaya街10号8号楼，邮编119121
摘要
本文提出了一种基于高分辨率原子力显微镜（AFM）成像数据来评估适配体/抗原复合物形成效率的方法。特定复合物的形成是医学诊断系统的基础。研究表明，通过全面分析从蛋白质及其复合物溶液中吸附到新鲜切割云母表面的物体的高度和体积，可以评估溶液中复合物形成的成功程度。该方法的应用通过两种CA125抗原变体（分别含有7个和1个完整的SEA结构域）以及两种适配体进行了验证。SEA结构域是抗体或适配体介导的生物识别系统中的结合位点。
引言
为了解决包括肿瘤疾病在内的社会性重要疾病的诊断问题，需要新型的高灵敏度生物分析系统。现有常规系统的灵敏度不足，导致病理状态只能在疾病发展的晚期才被发现[7]。对于卵巢癌的早期检测，这种高灵敏度系统尤为迫切，因为在该疾病中，蛋白质生物标志物在生物样本（血浆或血清）中的浓度极低。为了检测这些蛋白质标志物，可以利用生物识别原理，即目标蛋白质与分子探针（抗体或适配体）形成特定复合物，并通过分析方法记录复合物的形成过程。分子探针的亲和性质以及检测方法的灵敏度是影响整个生物分析系统灵敏度的关键因素。
CA125是一种广泛用于卵巢癌诊断和治疗效果评估的生物标志物。这种蛋白质属于糖蛋白，分子量为2.5–5 MDa [10]。CA125（MUC16）是一种I型跨膜粘蛋白，由3个主要结构域组成：细胞外的N端结构域、具有串联重复序列的区域和SEA结构域，以及包含跨膜区域和短胞质尾部的羧基末端结构域（图1）[4]。SEA结构域具有抗原性，因此现有的分子探针主要针对这些蛋白质区域进行设计[12]。在常规的CA125生物分析系统中，通常使用抗体作为分子探针[8]，但它们存在一些缺点。最近，人们提出使用适配体进行蛋白质检测，因为适配体相比抗体具有合成成本低廉以及在检测和储存条件下稳定性更好的优点。本研究探讨了使用两种适配体作为分子探针检测CA125的可能性。本研究采用的分析方法是原子力显微镜（AFM）。现有的生物标志物检测方法提供的是分子集合的信息，而AFM则能在单分子水平上记录信号[6]。为了构建基于AFM分子检测器的高灵敏度分析系统，需要了解适配体与蛋白质形成复合物的可能性。通过分析吸附在新鲜切割云母表面的物体的形态特征（包括高度和横向尺寸），可以评估复合物的形成情况。高度的测量精度可达到0.1 nm，但可视化物体的横向尺寸受AFM图像大小、扫描步长、探针曲率半径等因素的影响。当使用曲率半径在1 nm到3 nm范围内的探针时，可以获得高分辨率的数据，从而能够区分蛋白质及其复合物的结构特征，例如纤维蛋白原[9]、免疫球蛋白M [1]和G [5]的结构。为了成功可视化生物大分子，表面上的物体需要处于单体状态。
在[11]中，确定了针对CA125蛋白的适配体序列，并选出了两种最具特异性的适配体。为了验证适配体的特异性，在[11]中使用了CA125_1蛋白的类似物。在本研究中，使用AFM对从溶液中吸附的蛋白质分子及其与适配体形成的复合物进行了可视化（针对两种类型的适配体）。在之前的研究中，我们曾使用可视化物体的最大高度来估计适配体/蛋白质复合物的形成情况[2]。为了获得更可靠的复合物形成数据，建议考虑可视化物体的体积。然而，确定体积需要知道物体的横向尺寸，而横向尺寸已知会受到成像分辨率的影响[3]。本研究采用微调模式进行测量，使用了两种类型的探针：曲率半径为10 nm（标准探针）或小于3 nm（超锐利探针）。使用超锐利探针使我们能够根据可视化物体的体积来评估适配体/蛋白质复合物的形成效率。
本研究展示了利用AFM研究和分析适配体与蛋白质之间复合物形成的可能性，以卵巢癌标志物CA125为例。超锐利探针的使用表明，适配体_1可以与两种蛋白质形成复合物，而适配体_2则未能与任何分析的蛋白质形成复合物。
部分摘要
选择适合AFM可视化的蛋白质溶液浓度
图2 A-J显示了从1 nM到10 μM不同蛋白质浓度溶液中，CA125蛋白吸附到新鲜切割云母表面的结果（稀释步骤为10倍）。如图2（D, I, L）所示，在10 nM浓度下，CA125_1和CA125_2蛋白的表面分别观察到高度主要在0.8 nm到2.6 nm范围内的单个物体（图2.L）。最终选择了10 nM的浓度。
超锐利探针对适配体/蛋白质复合物的AFM可视化结果
图4展示了蛋白质和适配体/蛋白质复合物的典型AFM图像。处理结果总结在表1和图5中。
对于CA125_2蛋白，数据处理方法与CA125_1蛋白相同（如上所述）。
根据公式（1）计算，CA125_2的分子量为29.2 kDa，其体积应为51–55 nm3。
对CA125_2的实验数据进行近似处理后，发现高度分布的最大值位于
结论
本文提出了一种基于AFM成像数据评估复合物形成效率的方法。研究对象是与癌症相关的CA125抗原，但该方法也可用于其他对象。此外，这种方法成本较低，可用于评估分子探针和目标抗原的亲和性质。
材料与方法
本研究使用了两种来自不同制造商的CA125蛋白溶液：CA125_1（PX-P5181，ProteoGenix S.A.S., 法国）和CA125_2（HY-P7696，MedChemExpress USA，美国）。生物大分子从浓度为10 μM到1 nM的溶液中吸附到新鲜切割的云母表面。蛋白质稀释使用PBSD缓冲液（Pierce，美国），pH值为7.4，含有8 mM NaH2PO4、2 mM KH2PO4、140 mM NaCl和10 mM KCl。
适配体的序列
资金来源
本研究是在俄罗斯联邦长期基础研究计划（2021–2030年）（编号122,030,100,168–2）的框架下进行的。
CRediT作者贡献声明
M.O. Ershova：撰写初稿、可视化处理、方法设计、实验研究、数据整理。A.A. Valueva：可视化处理、实验研究。T.O. Pleshakova：撰写修订稿、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
AFM测量使用的是属于“Avogadro”大型研究设施的Titanium Solver多模式原子力显微镜。
本研究使用了生物医学化学研究所的“Human Proteome”核心设施的设备。
作者感谢Ivan V. Zinoviev在AFM数据处理方面提供的帮助。
