4D打印的ELISA针头面板测量仪

《Biosensors and Bioelectronics》：4D-printed ELISA needle panel meter

氯霉素检测无需显色/荧光的4DP针式传感器基于红ox响应材料，通过抗体竞争结合消耗H2O2实现针体弯曲检测，验证了在多种食品样本中的准确性和便携性。

　　

邱小初|苏成宽

国立中兴大学化学系，台湾台中市402227

摘要

酶联免疫吸附测定（ELISA）常用于检测和定量食品样品中的抗生素。为了实现无需任何显色或荧光分析的现场氯霉素（CAP）ELISA，我们利用数字光处理四维打印（4DP）技术和含有2,2′-(乙基烯二氧)二乙硫醇（EDT）的树脂，制造了一种具有氧化还原响应针头的面板仪表。当共聚物中的硫醚基团被氧化时，会导致含有EDT的打印层与非响应层之间出现不均匀膨胀，从而使针头发生[过氧化氢（H₂O₂）]依赖的弯曲。我们优化了面板表面抗CAP抗体的涂层，以进行竞争性ELISA。基于CAP与标记有CAP的辣根过氧化物酶（CAP-HRP）之间的竞争，结合的CAP-HRP消除了额外添加的H₂O₂，从而使针头发生[CAP]依赖的弯曲，该方法的最小检测限为2.5 pg mL^?1

引言

免疫测定依赖于抗体和抗原之间的特异性相互作用，是检测包括化学物质、生物分子、细胞和病毒在内的多种物质的强大技术（Hennion和Barcelo，1998；Darwish，2006）。通过利用固定化在固体平台（例如96孔微孔板）上的抗体与液体样品中的抗原之间的固相反应，以及辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶等酶标签来放大抗体-抗原结合事件，例如在过氧化氢（H₂O₂存在下对显色和荧光底物[例如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）、o-苯二胺和10-乙酰-3,7-二羟基吩嗪]的氧化作用，酶联免疫吸附测定（ELISA）已成为医院和实验室中最常用的诊断工具（Hennion和Barcelo，1998；Darwish，2006；Xiong等人，2020；Peng等人，2022；Aydin等人，2025）。除了设计简单、操作方便和高灵敏度外，ELISA的自动化液体处理（例如加载、移液和清洗）可以减少人力需求和潜在有害化学物质的暴露（Zhou等人，2021；Zedan等人，2022；Borah和Dutta，2025）。

ELISA的应用已扩展到现场检测和诊断应用（Cucci等人，2007；Zhang等人，2016；Djaileb等人，2021；Ma等人，2021；Peng等人，2022；Zhao等人，2022；Shan等人，2023；Borah和Dutta，2025；Chen等人，2025）。例如，Djaileb等人开发了一种用SARS-CoV-2抗原功能化的便携式表面等离子体共振传感器，用于检测临床样本中的人类抗SARS-CoV-2免疫球蛋白G抗体（Djaileb等人，2021）。Ma等人通过将纸/聚合物混合微流控设备与多种颜色变体集成，利用数字单反相机记录的红色平均值，开发了一种多色ELISA平台，用于检测丙型肝炎病毒（Ma等人，2021）。Shan等人制备了抗体修饰的镧系荧光微球作为供体探针，结合自制的便携式滤光片基荧光微孔板读数器，用于检测猪流行性腹泻病毒（Shan等人，2023）。尽管这些方法大大提高了ELISA在现场应用的便利性，但从抗体-抗原结合产生酶标记信号通常需要定量的显色或荧光分析，这意味着仍需要电力驱动的设备（例如分光光度计、荧光计、智能手机和电化学分析仪）来获得可靠的定量结果（Cucci等人，2007；Zhang等人，2016；Djaileb等人，2021；Ma等人，2021；Zhao等人，2022；Shan等人，2023；Chen等人，2025）。新的分析策略能够实现简便、高效和灵敏的抗体-抗原相互作用检测，从而提高传统ELISA在常规和现场分析研究中的检测能力和适用性（Xiong等人，2020；Peng等人，2022）。

最近，能够感知环境变化（例如温度、光、[H⁺]、离子、湿度、氧化还原条件、电场或磁场以及生物信号）并发生物理、化学或生物变化的刺激响应材料在分析应用中越来越受到重视（Islam等人，2013；Lorenzo等人，2015；Hu等人，2019；Guo等人，2020；Zhang等人，2021，2025；Trovato等人，2022）。此外，由于分析概念简单、操作方便、不需要电力驱动设备且成本较低，刺激响应分析设备正成为定量化学分析的关键传感组件（Hu等人，2019；Guo等人，2020；Zhang等人，2021，2025；Trovato等人，2022）。在这些刺激响应材料中，能够选择性响应某些氧化还原条件的氧化还原响应材料（Greene等人，2017；Mugo和Lu，2020；Nakahata等人，2011；Wang等人，2021；Jo等人，2023a；Jo等人，2023b；Pu等人，2024；Robby等人，2024）更适合用于开发无需严格控制实验条件的氧化还原响应设备。例如，Mugo和Lu制造了一种灵活的氧化还原响应电容传感器，由多层银纳米粒子、碳纳米管/纤维素纳米晶体和装载有酶的纳米铁凝胶组成，用于基于纳米铁凝胶体积和电容的氧化诱导变化来敏感检测H₂O₂和代谢物质（Mugo和Lu，2020）。Jo等人制造了一种pH值和活性氧响应的电导水凝胶传感器，其中含有二硒化物交联的碳点负载的两性聚合物点，用于基于水凝胶导电性的膨胀诱导变化来选择性检测癌症微环境（Jo等人，2023b）。然而，氧化还原响应和/或非响应材料通常需要使用预先制备的掩模或模板进行堆叠，这需要精细的对齐和粘合步骤，使得氧化还原响应传感设备的制造既费力又耗时，并可能限制这些设备的应用范围（Greene等人，2017；Mugo和Lu，2020；Nakahata等人，2011；Wang等人，2021；Jo等人，2023a；Jo等人，2023b；Pu等人，2024；Robby等人，2024）。因此，需要更高效的制造方案来加速用于现场ELISA应用的智能氧化还原响应传感设备的开发（Wu等人，2022，2023；Chiu和Su，2025）。

将三维打印（3DP）技术与刺激响应材料结合，将时间效应作为打印设备的第四维度，四维打印（4DP）技术正在推动刺激响应设备的制造，以实现相应的刺激诱导形状编程和几何功能（Ryan等人，2021；Tariq等人，2023；Lyu等人，2023；Wan等人，2024；Ding等人，2025）。尽管越来越多的4D打印氧化还原响应设备被用于驱动和药物递送（Javed等人，2020；Bagheri等人，2021；Lu等人，2022；Regato-Herbella等人，2024），但目前还没有利用4D打印氧化还原响应设备的形状编程程度作为可靠ELISA定量策略的分析方案。4D打印的氧化还原响应分析设备有望用于报告抗体-抗原相互作用的酶标记信号，从而降低现场ELISA的复杂性和成本。

氯霉素（CAP）是一种广泛用于治疗患病动物的抗生素（Samsonova等人，2012；Sun等人，2023）。然而，CAP在人体内的积累可能导致造血毒性和中性粒细胞减少性贫血（Khoshbin等人，2018；Karikalan等人，2023；Sun等人，2023）。因此，必须开发能够在现场确定CAP的分析技术，特别是对于动物产品和加工食品。为了开发无需使用显色或荧光底物和昂贵测量设备的便携式传感设备，我们采用了数字光处理（DLP）4DP技术和含有2,2′-(乙基烯二氧)二乙硫醇（EDT）的树脂，制造了一种具有氧化还原响应针头的面板仪表，该针头由附着在非响应层上的含有EDT的层组成。由于共聚物中的硫醚基团被氧化，导致两个打印层之间出现不均匀膨胀，针头表现出H₂O₂依赖的弯曲，作为选择性检测H₂O₂的替代显色或荧光底物。我们优化了面板表面抗CAP抗体的固定化方案，以进行竞争性ELISA。在CAP与标记有CAP的HRP（CAP-HRP）对抗CAP抗体的竞争过程中，结合的CAP-HRP消除了添加的H₂O₂，而无需任何显色或荧光底物，从而证明了针头的[CAP]依赖性弯曲用于CAP的检测。在优化了4D打印氧化还原响应针头面板的制造和在面板表面涂覆抗CAP抗体以进行竞争性ELISA之后，我们通过分析鲑鱼、虾、白肉、猪肉、蜂蜜和牛奶样品，并将其结果与使用TMB作为显色底物并通过微孔板读数器进行检测的传统ELISA结果进行比较，评估了该方法的分析性能，并验证了其可靠性和适用性。通过将4D打印的氧化还原响应针头面板仪表与ELISA结合，通过表面固定特定抗体，我们表明4D打印设备可以应用于各种分析应用，具有操作复杂性降低、成本减少、便携性提高和免疫传感性能增强等优势。

部分摘录

化学品

EDT（465178）、CAP（C0378）、氢氧化钠（NaOH；30620）、六亚甲基二胺（HMD；H11696）、戊二醛（GA）溶液（50%；G6403）、磷酸二氢钠（Na₂HPO₄；S0876）、氯化钠（NaCl；V900058）、甲酸（33015）、硫酸钠（Na₂SO₄；31481）、三钠柠檬酸酯脱水物（C8532）、TMB（T2885）和H₂O₂（31642）从Merck购买。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC；A10807）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS；157270250）、钠

氧化还原响应针头面板的4DP

为了实现无需任何显色或荧光分析的CAP ELISA，我们使用DLP 4DP技术和含有EDT的树脂开发了ELISA针头面板仪表（图1）。我们优化了氧化还原响应针头面板的制造、在面板表面涂覆抗CAP抗体以及竞争性ELISA（图S3），以获得最佳的分析性能。

因为共聚物中硫醚基团的氧化会导致亚砜和砜基的形成（图）

结论

我们开发了涂有抗体的4D打印ELISA针头面板仪表，用于基于针头的弯曲来现场确定CAP，无需显色或荧光分析，也无需使用任何昂贵的测量设备。与之前报道的免疫化学测定方法和设备相比，我们的设备具有显著优势。（i）我们的方法不需要任何精细的对齐和粘合步骤，因为氧化还原响应针头可以轻松打印

CRediT作者贡献声明

邱小初：可视化、验证、方法学、数据管理。苏成宽：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督、资源管理、项目管理、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢国家科学技术委员会（台湾）提供的财政支持（资助编号NSTC 114-2113-M-005-015）。