《Biosensors and Bioelectronics》：Routine monitoring of microRNAs in salivary exosomes using a cellulose nanofiber sheet
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唾液液态活检中纤维素纳米纤维片用于稳定捕获和储存与微小外泌体结合的miRNA，具有体积小（10μL）、处理快（<1分钟）、室温稳定储存优势，并成功区分健康与癌症患者miRNA表达谱，适用于日常监测和早期癌症检测。
荒木泰树（Taiga Ajiri）、张敏（Min Zhang）、水神直也（Naoya Mizukami）、飯田美紀子（Mikiko Iida）、川口翔太（Shota Kawaguchi）、关原百合絵（Yurie Sekihara）、查特莱拉特·库纳农（Kunanon Chattrairat）、朱泽涛（Zetao Zhu）、 Baba Yoshinobu、古贺宏隆（Hirotaka Koga）、安井隆夫（Takao Yasui）
东京理化学研究所生命科学技术部，日本横滨市绿区长津田4259，邮编226-8501
摘要
液体活检是一种有前景的非侵入性疾病监测方法，具有频繁采样和早期风险评估的潜力。在各种生物流体中，唾液因其易于采集且侵入性小而特别适合日常采样。本文提出了一种纤维素纳米纤维片材，作为快速、低体积回收和稳定储存唾液中与小细胞外囊泡相关的miRNA的新平台。该片材通过其纳米级多孔网络捕获囊泡，并在室温下保持其内容物，从而高效提取与囊泡相关的miRNA。与超速离心法相比，该方法显示出更好的miRNA回收率，仅需要10微升唾液和不到一分钟的处理时间。对健康个体和癌症患者的唾液miRNA谱分析显示了不同的表达模式，有助于识别潜在的癌症相关miRNA。此外，连续20天的每日唾液采样证明了纵向miRNA分析的可行性，并突显了食物摄入等因素的影响。这些发现强调了纤维素纳米纤维片材作为唾液miRNA监测实用工具的潜力，可应用于个性化健康管理、早期风险检测和分散式检测环境。
引言
液体活检提供了一种非侵入性和多功能的方法，可用于早期癌症检测，并有潜力整合到常规健康监测中（Heitzer等人，2017年；Li等人，2019年；Bando等人，2020年）。在各种生物流体中，唾液因其易于采集、成本低且可重复采集而特别具有吸引力，非常适合日常采样。唾液含有多种生物分子，包括蛋白质、DNA、RNA和代谢物，这些分子已被提出作为多种疾病的诊断标志物（Nagler，2009年；Sugimoto等人，2010年；Kaczor-Urbanowicz等人，2017年；Tengler等人，2024年）。特别是微小RNA（miRNA），它们在转录后调节基因表达，被认为是稳定的和疾病特异性的生物标志物，并在2024年诺贝尔生理学或医学奖的授予中得到了认可（Lee等人，1993年；Wightman等人，1993年；Pasquinelli等人，2000年）。在miRNA中，那些包裹在细胞外囊泡（EVs）中的miRNA因具有抗酶降解性和反映疾病相关分子变化的潜力而受到广泛关注（Yasui等人，2017年；Kitano等人，2021年；Takahashi等人，2021年；Yokoi等人，2023年；Yasui等人，2024年；Zhang等人，2024年）。一些源自EV的miRNA已被报道为多种癌症的有希望的生物标志物（Yasui等人，2017年；Limin Zhang，2023年；Lin Zhu，2023年；Yokoi等人，2023年；Yang等人，2025年）。同时，超灵敏miRNA生物传感技术的最新进展进一步加速了基于EV的RNA诊断的临床转化（Chattrairat等人，2023年；Chattrairat等人，2024年；Yang等人，2025年）。
尽管具有诊断潜力，但由于唾液的性质和现有分离方法的局限性，基于唾液的miRNA分析在技术上仍具有挑战性。唾液中含有多种蛋白质和大型分子，如黏蛋白、α-淀粉酶和富含脯氨酸的肽，这些物质会干扰囊泡的分离，通常需要复杂的预处理步骤（Iwai等人，2016年）。超速离心是最常用的富集小囊泡（如外泌体）的方法，但需要大量的样本量和较长的处理时间，这可能会影响样本的完整性（Iwai等人，2016年；Tengler等人，2024年）。此外，富集囊泡的样本通常需要在-80°C下储存以保持RNA的稳定性（Wang等人，2023年），这对频繁或分散式检测带来了物流限制。这些因素共同阻碍了唾液来源的miRNA分析在日常临床或个人健康应用中的实施。因此，迫切需要一种更实用和稳健的方法来分离和稳定与囊泡相关的miRNA。
在这项研究中，我们旨在探索通过EV富集制备法回收的唾液来源的miRNA，因为它们作为可获取且信息丰富的生物标志物具有潜力。虽然我们之前的研究已经报道了纤维素纳米纤维（CNF）片材在捕获其他体液中的EV和RNA保存方面的实用性（Yokoi等人，2023年），但将其应用于唾液（一种具有独特成分挑战的基质）尚未进行研究。现有的EV分离方法，如超速离心和尺寸排阻色谱，在产量、纯度、工作流程复杂性和可扩展性方面存在权衡，且通常不适用于低体积或室温下的唾液处理。与之前的研究不同，本研究专注于针对唾液（一种高粘度、富含酶的生物流体）优化该平台，并评估其在日常采样、长期室温储存和使用临床唾液样本进行疾病相关miRNA分析方面的可行性。这些应用在我们的先前工作中未曾探索，代表了本研究的关键进展。此外，CNF片材具有作为唾液囊泡捕获和储存基质的理想材料特性。它们由缠结的纳米纤维网络组成，在纳米尺度上形成数十到数百纳米的孔隙，这与外泌体大小（40–200纳米）相匹配，能够将囊泡物理捕获在三维结构中。它们的亲水表面化学性质使唾液样本能够通过毛细力自发渗透到片材中，无需外部泵送，这对于处理微量样本非常有利。从实际角度来看，纤维素纳米纤维现在可以在工业规模上生产，全球CNF市场预计到2030年将达到20亿美元（MarketsandMarketsTM，2023年），表明它们作为一种低成本、可大规模生产的基质的潜力。此外，CNF片材干燥引起的孔隙闭合固定了捕获的囊泡，有助于在室温下稳定囊泡相关的miRNA。基于此，我们提出CNF片材作为一种简单的平台，用于从唾液中富集小囊泡并稳定其miRNA含量。
在这项研究中，我们评估了纤维素纳米纤维片材在捕获和稳定小唾液囊泡及其miRNA载荷方面的性能。我们优化了关键实验参数，如唾液体积、干燥时间、洗涤步骤和储存时间，以确保一致的miRNA回收率。为了考察潜在的临床应用，我们使用该平台对肺癌和胃癌患者的唾液样本与健康个体的唾液样本进行了miRNA分析。结果表达模式显示出可用于癌症监测和分层的独特特征。这些结果证明了我们使用最小处理过的唾液样本进行miRNA分析的方法的可行性。总体而言，我们的发现支持CNF片材作为日常miRNA监测和通过非侵入性采样进行早期疾病检测的实用工具的潜力。
章节片段
使用纤维素纳米纤维片材回收唾液来源的miRNA
在这项研究中，我们开发了一种快速简便的方法，使用CNF片材分离唾液来源的囊泡及其相关的miRNA。该片材由通过机械纺丝木材浆纤维获得的纤维素纳米纤维制成，这些纳米纤维具有较大的比表面积和丰富的羟基（Li等人，2021年），形成了高度缠结的纳米多孔网络。
结论
在这项研究中，我们开发了一种CNF片材，并验证了其作为简单、快速和有效的平台，用于回收和监测与小EVs相关的唾液miRNA的诊断能力。该方法仅需要10微升唾液，处理时间不到一分钟，并允许在室温下储存而不影响miRNA的完整性。与传统技术相比，该片材显示出更好的miRNA回收率和实际优势。
CRediT作者贡献声明
朱泽涛（Zetao Zhu）：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、正式分析。Baba Yoshinobu：撰写 – 审稿与编辑、可视化、方法学、概念化。古贺宏隆（Hirotaka Koga）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念化。安井隆夫（Takao Yasui）：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、可视化、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析。
未引用的参考文献
Limin Zhang等人，2023年；Lin Zhu等人，2023年；Yang等人，2025年；Yokoi等人，2023年。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了新能源和工业技术发展组织（NEDO）JPNP20004（授予T.Y和H.K）、月球射击研究与发展计划（授权号22zf0127004s0902和JP22zf0127009）（来自AMED（授予T.Y）、日本科学技术机构（JST）AIP加速研究（JPMJCR23U1授予T.Y）、JSTCREST（授权号JPMJCR2576授予T.Y和H.K）和FOREST（JPMJFR2003授予H.K）、JSPS科学研究资助（A）24H00792（授予T.Y）的支持。
