《Biosensors and Bioelectronics》：In-situ sampling and monitoring ctDNA from dermal interstitial fluid for tumor diagnosis
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检测皮肤间质液中循环肿瘤DNA（ctDNA）的新方法：基于反向离子迁移的微针-电化学传感器平台，实现10 fM-1 nM宽线性范围检测，灵敏度达1.92 fM，并通过小鼠模型验证与PCR技术一致性，为无创癌症监测提供新途径。
吴振宇|陈静|张玉哲|葛如飞|李燕|Khaydar E. Yunusov|Fozil Mamarayim Ugli Turakulov|蒋国华
浙江科技大学材料科学与工程学院，杭州310018，中国
摘要
检测皮肤间质液（ISF）中的循环肿瘤DNA（ctDNA）提供了一种无创的癌症诊断方法，尽管临床应用常常受到提取效率和灵敏度低的限制。本研究提出了一种集成微针-电极平台，用于原位采样和监测ctDNA。利用反向离子导入法从真皮ISF中提取ctDNA，然后通过信号放大的rGO/PPy/Au纳米粒子电化学传感器进行检测。该平台具有宽线性范围（10 fM至1 nM）和低检测限（1.92 fM），对碱基错配和生物干扰物具有高特异性，并且重复性良好。在鼠肿瘤模型上的体内测试结果显示，其结果与qPCR和ddPCR高度一致，显示出其在即时癌症诊断和疾病监测方面的潜力。
引言
循环肿瘤DNA（ctDNA）是血液中的一种特定基因组片段（Riva等人，2017；Stadler等人，2022），其在血液或间质液（ISF）中的浓度与肿瘤负荷呈正相关，使其成为预后评估的理想液体活检生物标志物（Wang等人，2021）。除了传统的聚合酶链反应（PCR）或DNA测序（Emaus等人，2021；Pessoa等人，2020）之外，新的方法还包括比色法（Yang等人，2019）、荧光法（Jantarat等人，2021）、电化学发光（Wang等人，2021）、光电化学方法（Saha等人，2018）和表面增强拉曼散射（Zang等人，2019）。其中，电化学传感器因其便携性、低成本和高灵敏度而在即时检测（POCT）中特别有前景。
皮肤是通过微创技术收集生物标志物的合适器官（Miller等人，2018；Zhang等人，2025）。ISF主要位于真皮和皮下组织（Liu等人，2024）中，含有大部分血液成分，包括超过92%的RNA类型和超过90%的循环蛋白质（Taylor等人，2018）。它靠近皮肤表面，便于无痛获取且不会发生凝血（Pang等人，2024），具有重要的诊断潜力。
由聚合物、硅或金属制成的微针（MNs）可以无痛地穿透角质层以获取ISF（Prausnitz等人，2017；González García等人，2018）。中空或多孔微针通过毛细作用或固定捕获探针来增强ISF的提取（Coffey等人，2013；He等人，2022）。例如，水凝胶微针能够以93.6%的效率捕获Epstein–Barr病毒无细胞DNA（EBV Cf DNA）（Yang等人，2019），而结合DNA门控MOFs的水凝胶微针实现了敏感的miRNA检测（Zou等人，2025）。然而，目前的基于微针的检测方法在灵敏度、准确性和特异性方面仍存在局限性。
反向离子导入法（RI）可以通过两种机制有效提取ISF成分（Zheng等人，2017）：1）施加的电场作用于表皮和乳头层真皮中的分子（Yang等人，2020）；2）生理pH值下皮肤的净负电荷诱导从阳极到阴极的电渗流，将ISF吸引到表面，而像ctDNA这样的负电荷分子则通过电迁移向阳极移动（Yao等人，2025；Giri等人，2017）。因此，与毛细作用相比，RI显著提高了提取速率，尽管其在大分子如核酸中的应用报道较少。
为了提高微针平台检测ctDNA的捕获效率和灵敏度，本研究提出了一种原位采样和监测系统，该系统通过RI过程将中空金属微针与电化学传感电极集成在一起。工作电极经过还原氧化石墨烯（rGO）、聚吡咯（PPy）和金纳米粒子（Au NPs）修饰。二维rGO提供了较大的生物分子吸附表面积（Xia等人，2020），PPy薄膜增强了Au NPs的稳定性（Lee等人，2021；Song等人，2021），而Au NPs通过强Au-S键实现了巯基末端DNA探针的牢固定向固定（Wu等人，2025；Zha等人，2023）。该系统能够高效地从ISF中提取ctDNA并进行实时电化学检测，为敏感的ctDNA监测提供了一种潜在的微创方法。
部分内容
rGO/PPy/Au纳米粒子电极的制备
rGO是根据改进的Hummers方法从天然石墨粉体制备的（Zhou等人，2023；Feng等人，2014）。丝印电极（SPE）均匀涂覆了1 nM的rGO分散液，然后在室温下干燥。随后，向SPE中加入含有0.2 M吡咯单体、0.1 M氯化钾（KCl）和0.1 M硫酸钠（Na2SO4）的溶液，以10 mV/S的扫描速率在0 - 0.7 V的电压范围内进行恒电流沉积，持续100秒。
电极的制备
通过依次沉积rGO、PPy和Au NPs构建高表面积的工作电极，随后固定甲基蓝修饰的单链DNA（MB-ssDNA）并用6-巯基-1-己醇（MCH）封闭。如图1a所示，二维rGO支架支撑导电的PPy层和Au NPs，优化了DNA固定的活性区域。MB作为杂交指示剂，插入双链DNA骨架中（Lee等人，2020）。当目标ctDNA结合时，
结论
本研究成功开发了一种基于金属微针的新型电化学生物传感器，用于检测ctDNA。该生物传感器使用与印刷电路板（PCB）兼容的微针来获取组织液，通过RI提取富集ctDNA，并使用rGO/PPy/Au纳米复合材料进行信号放大。rGO和Au NPs的结合协同增强了电子转移效率，为DNA探针的固定提供了高密度平台。
CRediT作者贡献声明
吴振宇：撰写——原始稿件、方法学、研究、数据分析。Khaydar E. Yunusov：撰写——审稿与编辑、资源提供。李燕：撰写——审稿与编辑、方法学、研究。蒋国华：撰写——审稿与编辑、撰写——原始稿件、监督、项目管理、资金获取、概念构思。Fozil Mamarayim Ugli Turakulov：撰写——审稿与编辑、资源提供。葛如飞：撰写——审稿与编辑、数据分析
未引用的参考文献
Emaus等人，2019；Prausnitz，2017；Wang等人，2021；Yang等人，2019；Zhang等人，2019；Zheng等人，2023。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了中国浙江省自然科学基金的华东医学联合基金（LHDMZ23H300003）、中央政府支持地方科技发展的基金（2025ZY01083）以及浙江省教育厅的普通研究项目（24105002-F）的支持。
