《Cancer Letters》：Copper ionophores drive divergent responses to immune checkpoint inhibition across colorectal tumor models
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铜结合剂触发免疫原性细胞死亡并调节免疫检查点抑制剂反应，但肿瘤铜代谢、剂型化学和微环境如何影响这些效应尚不明确。本研究在CT26和MC38结肠癌细胞模型中评估了Cu(DDC)?和Cu(CQ)?，发现其通过铜积累和同位素分馏改变肿瘤免疫微环境，其中Cu(CQ)?在CT26模型中短期增强PD-1抑制效果，长期则促进免疫抑制，而MC38模型中联合治疗无额外益处。提示肿瘤内铜代谢特征与剂型化学共同决定免疫应答，铜同位素可作为联合治疗生物标志物。
德文·赫鲁（Devon Heroux）|徐欣孙（Xu Xin Sun）|张思杰（Sijie Zhang）|玛丽亚姆·沙里菲阿格达姆（Maryam Sharifiaghdam）|梁艾达·W·Y（Ada W.Y. Leung）|赛义德·法尔扎内（Saeid Farzaneh）|凯蒂·米尔恩（Katy Milne）|特雷弗·麦克法兰（Trevor MacFarlane）|尚塔尔·迪维托（Chantal Di Vito）|布拉德·H·纳尔逊（Brad H. Nelson）|查尔斯·沃尔斯比（Charles Walsby）|马塞尔·B·巴利（Marcel B. Bally）
加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市BC癌症研究所基础与转化研究部门
摘要
铜结合剂能够触发免疫源性细胞死亡（ICD），并调节对免疫检查点抑制剂（ICIs）的反应，但肿瘤中的铜代谢机制、铜结合剂的化学性质以及肿瘤微环境如何影响这些效应尚不清楚。我们在两种具有不同铜代谢特征的异基因结直肠癌模型中评估了二乙基二硫代氨基甲酸盐 [Cu(DDC)2] 和氯喹诺尔 [Cu(CQ)2] 的作用。体外转录组学和细胞因子分析显示这些化合物特异性地激活了铜死亡（cuproptosis）和免疫相关通路。在体内实验中，铜的积累及其同位素分布与肿瘤微环境的免疫特征（包括免疫细胞浸润和钙调神经磷酸酶钙调蛋白的暴露）相关。在CT26肿瘤中，Cu(CQ)2最初增强了程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的抑制作用，但长期使用后反而促进了免疫抑制。在MC38肿瘤中，联合治疗未能显示出额外的治疗效果。这些数据表明，肿瘤自身的铜代谢机制和铜结合剂的类型共同决定了免疫动态和治疗效果，提示铜的同位素指标可作为基于铜的免疫检查点抑制剂策略中的潜在生物标志物，需要进一步研究。
引言
铜死亡（cuproptosis）是一种新近发现的调控性细胞死亡形式，其机制不同于凋亡（apoptosis）、铁死亡（ferroptosis）和其他经典细胞死亡途径。1该过程的特点是铜（Cu）与三羧酸循环（TCA）中的脂质化成分结合，导致线粒体蛋白聚集、铁硫簇蛋白不稳定以及线粒体功能障碍。1, 2, 3自铜死亡被发现以来，人们一直在研究其作为靶向代谢活跃肿瘤细胞并引发免疫源性细胞死亡（ICD）的方法。4, 5, 6
铜死亡相关基因（CRGs）的表达与免疫表型、治疗敏感性及治疗结果密切相关。7, 8, 9在结直肠癌（CRC）中，高水平的CRGs表达通常与较差的生存率相关8，多项研究也发现CRGs表达增加与免疫细胞浸润和免疫组成改变有关，但其具体功能后果尚不明确。跨癌症类型的分析显示，CRGs的异质性与药物敏感性、免疫亚型和预后相关，且这些关系受代谢依赖性和免疫环境的影响。7这些发现表明，铜死亡机制能够反映肿瘤生物学的关键特征，有助于患者分层和治疗方案的制定。
同时，纳米技术推动了对铜死亡机制的治疗探索。金属-有机框架、仿生纳米颗粒、水凝胶和混合结构等平台逐渐被用于递送铜离子载体及相关调节剂，并兼具免疫调节功能。4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22许多这类递送系统包含氧化还原耗竭机制（如谷胱甘肽消耗、活性氧放大、FDX-1代谢靶向或类似芬顿反应），以克服耐药性并增强ICD效应。10, 11, 14, 20, 21, 23尽管设计各异，但这些方法普遍能诱导ICD、增强抗肿瘤免疫反应并改善对免疫治疗的响应，尤其在结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤中表现出协同作用。4, 10, 11, 12, 14
然而，肿瘤内在特征、治疗持续时间以及铜离子载体的性质如何影响免疫反应仍需进一步研究。在结直肠癌（CRC）中，这一复杂性尤为突出，因为除了MSI-H亚型外，免疫检查点抑制剂的效果较差，这使得探索重塑肿瘤-免疫相互作用的战略变得尤为重要。先前的研究发现CT26和MC38 CRC模型在总铜含量和铜同位素分布上存在差异，暗示了它们在铜代谢和免疫环境方面的内在差异。24从治疗角度来看，最新研究表明铜载体的化学性质可能独立影响免疫细胞浸润、肿瘤负荷及与免疫检查点抑制剂的协同作用。13, 18, 25此外，虽然急性铜暴露可诱导ICD4, 5, 13，但长期治疗的后果尚不明确，且可能因肿瘤类型而异。明确肿瘤表型、给药动力学和载体特异性机制如何共同影响免疫结果是一个重要问题。
为探讨这些问题，我们选择了两种具有不同配位化学性质和递送特性的铜结合剂：来自双硫仑（disulfiram）的Cu(DDC)2在低浓度下具有广泛的临床应用，可用于研究铜依赖性肿瘤应激（包括铜死亡相关通路）；而氯喹诺尔（Clioquinol）则是一种化学性质不同的铜结合剂，脂质体包封后可在肿瘤内积累更多铜并延长铜的暴露时间。这两种试剂为研究铜的配位、递送和生物分布差异如何影响同一肿瘤环境中的应激信号传导和免疫反应提供了互补模型。本研究使用Cu(DDC)2和Cu(CQ)2作为代表递送复合物，评估了它们与免疫检查点抑制剂联合使用的效果，包括转录反应、铜同位素分布及免疫细胞浸润的变化。
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和胆固醇（Chol）购自Avanti Polar Lipids（阿拉巴斯特，AL）。[3H]-胆固醇十六烷基醚（CHE）和Picofluor-15闪烁液购自Perkin Elmer（波士顿，MA，美国）。RPMI 1640、DMEM、EMEM、Ham's F-12、0.25%胰蛋白酶-EDTA、无钙/镁的HBSS、Hoechst 33342和CellMask Deep Red购自Thermo Fisher Scientific（沃尔瑟姆，MA，美国）。FBS和L-谷氨酰胺购自Life Sciences公司。
小鼠异基因肿瘤模型中的铜相关细胞死亡和代谢通路特征
小鼠异基因肿瘤模型用于通过特定的细胞死亡途径研究治疗反应。了解基础细胞死亡敏感性对于靶向治疗至关重要，但目前针对常用小鼠肿瘤模型的细胞死亡相关转录程序的系统性比较仍有限。本研究测定了十种常见细胞系（结肠癌CT26、MC38、乳腺癌4T1、EMT6、肾癌RENCA）的基线基因表达情况，以评估与细胞死亡相关的基因。
本研究探讨了铜作为免疫调节剂在异基因结直肠癌模型中的作用，这些模型接受了免疫检查点抑制剂的治疗。通过测量治疗前后的总铜含量和铜同位素分布，我们发现血浆铜水平和同位素富集可能是潜在的疗效生物标志物。据我们所知，这是首次在免疫检查点抑制剂治疗过程中研究总铜和铜同位素分布的研究。
马塞尔·B·巴利（Marcel B. Bally）：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、方法学设计、资金获取、数据分析、概念构建。
德文·赫鲁（Devon Heroux）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、项目管理、方法学设计、实验实施、资金获取、数据分析、概念构建。
徐欣孙（Xu Xin Sun）：方法学设计、实验实施。
布拉德·H·纳尔逊（Brad H. Nelson）：监督、资源协调。
查尔斯·沃尔斯比（Charles Walsby）：监督、资源协调。
特雷弗·麦克法兰（Trevor MacFarlane）：
所有动物实验均遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）的指导方针，并获得了不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会（Animal Care Certificate A14-0290）的批准。人类来源的细胞系来自商业供应商，使用符合机构生物安全规定。本研究中未使用原代人体组织或患者数据。
处理后的RNA测序数据（包括标准化计数矩阵和差异表达结果）见支持信息。如需更多数据，可联系相应作者获取。
作者声明无利益冲突。
本研究得到了加拿大卫生研究院（Canadian Institutes of Health Research, 153132）、加拿大癌症协会（Canadian Cancer Society, 705290）和NanoMedicines创新网络（NanoMedicines Innovation Network, DRG 03190）的资助。德文·赫鲁（Devon Heroux）还获得了NanoMedicines创新网络的额外支持。我们感谢BC癌症基金会（BC Cancer Foundation）的协助。
作者感谢BC癌症研究所的PharmaCore部门（前身为Investigational Drug Program）在所有体内实验中的技术支持，特别是Nicole Wretham、Kianne Rodrigues、Ioana-Mihaela Popescu和Nancy dos Santos在项目管理方面的贡献。同时感谢Norman Chow的技术协助。图表制作使用了BioRender.com软件。
