《CATENA》：Grassland type exerts a stronger influence than grazing on the abundance, structure, and diversity of active diazotrophic communities in Mongolian natural grassland soils
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本研究通过RNA测序和定量PCR分析蒙古高原三种草原类型下放牧强度对土壤固氮微生物群的影响，发现草类型比放牧强度更显著影响群落结构，meadow steppe以Alphaproteobacteria为主，典型和荒漠草原以Gammaproteobacteria为主，固氮微生物丰度与土壤理化性质及气候因子正相关。
梁坤龙|白杭海|赵佳|王超军|Tumentsogt Anuundari|王正|Hugjiltu Minggagud|胡赫|鲍铁军|王新宇|马文红|郭伟|Ariuntsetseg Lkhagva|Frank Yonghong Li|鲍志华
中国内蒙古自治区大学生态与环境学院生态与资源利用重点实验室（隶属于教育部），呼和浩特市 010021
摘要
固氮微生物的生物固氮作用对自然草原生态系统的氮输入至关重要。尽管动物放牧是这些系统中的主要土地利用方式，但其对固氮菌群落的影响仍知之甚少。本研究采用基于转录本的定量PCR技术和nifH基因扩增子测序方法，评估了放牧对蒙古不同气候梯度下三种主要草原类型中活性固氮菌群落的多样性、组成和丰度的影响。草地草原土壤中的nifH基因转录本丰度（1.17 × 10^5–2.54 × 10^5拷贝/克干土）显著高于典型草原（2.66 × 10^4–5.10 × 10^4拷贝/克干土）和沙漠草原（1.93 × 10^4–2.66 × 10^4拷贝/克干土），而在同一草原类型内，不同放牧强度之间没有显著差异。RNA测序结果显示，草地草原中的活性固氮菌群落多样性最高。草原类型对固氮菌群落结构的影响大于放牧管理方式。在典型草原和沙漠草原中，活性固氮菌群落主要由γ-变形菌门（31.22%）主导；而在草地草原中则主要由α-变形菌门（58.32%）主导。nifH基因转录本的丰度与土壤理化性质、气候变量和植被特征呈显著正相关。土壤和气候因素是决定固氮菌群落模式的主要因素。本研究首次详细描述了经过数百年游牧影响的蒙古草原土壤中活性固氮菌群落的结构和丰度。
引言
氮（N）的可用性对植物生长至关重要，是陆地生态系统初级生产力的主要限制因素（LeBauer和Treseder，2008；Vitousek和Howarth，1991）。在自然环境中，氮主要通过两种途径进入陆地系统：大气氮沉降和生物固氮（Galloway等人，2008）。由固氮细菌和古菌介导的生物固氮是这些生态系统中氮输入的主要途径（Cleveland等人，1999；Dixon和Kahn，2004）。在此过程中，大气中的N2通过固氮酶转化为氨，使氮可供植物吸收（Dixon和Kahn，2004）。近年来，nifH基因因其普遍存在于固氮微生物中而被广泛用作检测不同环境中固氮微生物的分子标记（Harwood，2020；Zehr等人，2003）。关于环境样本中固氮细菌多样性的研究主要依赖于nifH基因的DNA水平分析（Che等人，2018a；Miao等人，2020；Wang等人，2017a；Wang等人，2017b）。然而，由于DNA在细胞死亡后仍可在土壤中存活，基于DNA的方法可能会捕获休眠或不活跃微生物的信号，从而可能高估活性固氮菌的贡献（Newell等人，2016）。相比之下，基于RNA的nifH转录本分析能更直接地评估生理活性固氮细菌。此外，DNA扩增子中可能存在伪nifH基因序列，这可能混淆分析结果（Mise等人，2021），并且一些固氮微生物虽然拥有完整的固氮基因簇，但缺乏转录活性或固氮酶活性（Zhu等人，2014）。因此，nifH表达的转录本水平分析能更准确地反映固氮微生物的活性（Bao等人，2025）。
草原是全球最广泛的陆地生态系统之一，覆盖了地球陆地表面的约40%。它们的生态稳定性日益受到气候变化和过度放牧的威胁（Tang等人，2019；Zhou等人，2017）。在温带草原系统中，氮输入主要由自由生活的固氮微生物的共生固氮作用驱动（Keuter等人，2014；Reed等人，2011）。以往关于草原土壤中固氮微生物多样性的研究主要关注全球范围内的分类结构和功能基因丰度（Che等人，2018a；Keuter等人，2014；Miao等人，2020；Tang等人，2019；Wang等人，2017a）。例如，在青藏高原的高海拔草原中，蓝细菌和α-变形菌门被确定为主要的固氮微生物，年降水量和养分可用性显著影响固氮微生物的多样性、组成和丰度（Che等人，2018a）。类似地，nifH基因扩增子测序显示，在内蒙古的沙质草原土壤中，变形菌门主导了固氮菌群落，其中Azospirillum、Bradyrhizobium和Mesorhizobium是关键类群（Miao等人，2020）。Wang等人（2017a）发现，沙漠草原中的固氮微生物群落结构与典型草原和草地草原有所不同，环境变化和气候变暖对非沙漠草原的破坏作用更为显著。此外，固氮菌群落的α-多样性和β-多样性主要受土壤pH值、植物群落组成和气候变量调控（Wang等人，2017a；Tang等人，2019）。这些发现共同表明，草原生态系统中的固氮菌群落组成受多种环境和气候因素的影响。关键的非生物驱动因素包括氧气可用性、无机氮浓度、有机质含量、土壤C/N比和土壤pH值，这些因素都会直接影响固氮微生物的结构和活性（Reed等人，2011）。例如，在高铵条件下，谷氨酰胺合成酶会被腺苷酸化，从而抑制其与固氮酶的相互作用，抑制生物固氮作用（Smercina等人，2019）。此外，高土壤C/N比与固氮微生物能量代谢所需的碳底物增加有关，从而增强固氮活性（Reed等人，2011）。此外，气候变化对高山草原土壤微生物群落组成的影响也大于放牧（Che等人，2018c），并且不同类型的草原中固氮菌群落存在差异（Wang等人，2017a）。然而，放牧对不同类型草原（如沙漠草原、典型草原和草地草原）中固氮菌群落的组成和丰度的影响程度尚不清楚。
放牧是草原生态系统中的关键土地管理方式，对植被分布、植物覆盖度（Sun等人，2023）、土壤理化性质及相关微生物群落有显著影响（Tang等人，2019）。作为草原中最主要和最普遍的土地利用方式，特别是在过度放牧的情况下，放牧会改变植物群落组成和生产力，加速土壤肥力丧失和养分耗竭（Wang等人，2017b）。研究表明，过度放牧会降低土壤有机碳（SOC）、总氮（TN）和水分含量（WC），同时适度提高土壤pH值（Wang等人，2021a；Zhou等人，2017）。因此，过度放牧被认为是草原退化的主要驱动因素。放牧还会改变植被分布和冠层覆盖度（Sun等人，2023）。此外，土壤理化性质也会影响固氮菌群落（Che等人，2018a），并且放牧还被报道会增加高海拔草原中氨氧化细菌和反硝化相关基因的丰度（Tang等人，2019）。这些发现表明，放牧强度可能调节参与碳和氮循环的土壤微生物群体的丰度和功能（Yang等人，2013）。
历史上，蒙古依赖畜牧业，过度放牧常常导致草原退化（Bardgett等人，2021；Rosen等人，2019）。几个世纪以来，蒙古草原一直采用游牧放牧系统，这与中国内蒙古等地区的轮牧或围栏放牧方式不同。游牧放牧被认为是一种低压力管理策略，可以防止任何单一区域的长期破坏。然而，不断增加的牲畜密度也导致了蒙古草原的广泛退化（Bardgett等人，2021）。此外，高纬度地区（>30°），包括蒙古高原的温带草原，大气氮沉降量较低，表明生物固氮在该地区的氮循环中起着关键作用（Zheng等人，2019）。
尽管越来越多的人认识到放牧的生态重要性，但其对不同类型自然草原中固氮菌群落组成和丰度的影响仍不清楚。因此，本研究探讨了以下问题：（1）在不同气候梯度下，固氮菌的丰度和群落组成如何变化？（2）放牧对固氮菌群落的丰度和群落结构有何影响？为回答这些问题，研究人员从沿气候干旱梯度分布的草地草原、典型草原和沙漠草原中采集了土壤样本，并根据放牧强度对采样点进行了分类，在蒙古东部草原地区选择了轻度放牧和重度放牧的样地。使用基于RNA的逆转录扩增子测序和定量PCR分析评估了气候条件和放牧制度对活性固氮菌的丰度、多样性和群落组成的影响。
站点描述和采样
研究地点（东经111°08′–114°61′，北纬43°77′–48°69′）位于蒙古南部温带气候区（图1和表1）。蒙古的草原面积占全国土地面积的约83%，拥有全球最高的草原面积人均值（Schneider等人，2020）。该地区处于干旱和半干旱地带，受东亚季风影响，具有典型的温带大陆性气候。夏季短暂而炎热，最高温度
三种草原类型的环境参数
草地草原的年平均降水量最高（314–341毫米），其次是典型草原（229–237毫米）和沙漠草原（144–152毫米）。相比之下，沙漠草原的年降水量和平均温度最高（表1）。在植被变量方面，草地草原和典型草原的植被覆盖度（FVC）、植物生物量（PB）和土壤容重（SR）显著高于沙漠草原。重度放牧显著降低了草地草原和典型草原的这些植被参数讨论
蒙古数千年来一直采用游牧放牧系统进行管理；然而，放牧强度与环境梯度在调节土壤微生物功能方面的相对重要性仍不清楚。本研究考察了放牧强度和草原类型对自然草原土壤中活性固氮菌群落的组成、多样性和丰度的影响。结果表明，草原类型（受广泛气候和土壤条件影响）结论
本研究考察了放牧强度和草原类型对蒙古自然草原土壤中活性固氮菌群的丰度、多样性和组成的影响。研究结果表明，草原类型对固氮菌群落的结构、丰度和多样性的影响大于放牧方式。在草地草原中，α-变形菌门是主要的固氮菌；而在典型草原和沙漠草原中，γ-变形菌门占主导地位作者贡献声明
梁坤龙：撰写初稿、可视化处理、数据验证、软件应用。白杭海：方法设计、调查、数据分析、数据管理。赵佳：调查、数据分析、数据管理。王超军：数据分析。Tumentsogt Anuundari：调查。王正：方法设计。Hugjiltu Minggagud：调查。胡赫：调查。鲍铁军：调查。王新宇：调查。马文红：调查。郭伟：调查。Ariuntsetseg Lkhagva：调查。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号2261143732）、内蒙古自治区自然科学基金（编号2024MS03073）和内蒙古自治区高等学校科学研究项目（编号NJZY21283）的支持。
