基本的磷酸钙晶体通过GPX4-NRF2介导的铁死亡机制，加剧与衰老相关的骨关节炎

《Cell Calcium》：Basic calcium phosphate crystals aggravate senescence-related osteoarthritis through GPX4-NRF2-mediated ferroptosis

BCP晶体通过诱导铁死亡和氧化应激加速骨关节炎软骨细胞衰老及病理进程，机制涉及GPX4-NRF2通路抑制。

　　

张彦涛|朱振星|纪培瑶|吴宇阳|明江华|周彦

武汉大学人民医院骨科，中国武汉430060

摘要

骨关节炎（OA）是一种与衰老密切相关的退行性关节疾病，涉及活性氧（ROS）积累和铁死亡（ferroptosis）等病理过程。在OA患者的关节中经常发现碱性磷酸钙（BCP）晶体，但其在该疾病发病机制中的作用仍不明确。本研究旨在探讨合成BCP晶体在促进OA进展中的作用，并阐明衰老的分子机制。通过向膝关节注射BCP晶体建立了大鼠OA模型，并研究了BCP晶体对OA软骨铁死亡表型的影响。此外，还观察了BCP处理后的软骨细胞中与衰老相关的生物标志物表达和线粒体功能的变化。同时，研究了合成BCP晶体在软骨细胞中促进铁死亡过程的作用及其与软骨细胞衰老的相关机制。体内实验结果表明，BCP晶体加速了软骨衰老，加重了软骨退化，促进了骨赘形成，并引发了关节滑膜的铁死亡。体外实验显示，BCP晶体增强了大鼠软骨细胞中的铁死亡和氧化应激，增加了ROS的产生，进一步促进了线粒体功能障碍和软骨细胞衰老。从机制上看，BCP晶体通过抑制GPX4-NRF2通路并诱导铁死亡来加剧与衰老相关的病理变化，从而促进OA进展。我们的发现表明，BCP晶体通过增强线粒体功能障碍和铁死亡来促进软骨细胞衰老，这种效应是通过下调GPX4-NRF2信号通路实现的，为探索OA的发病机制和治疗提供了理论基础。

引言

骨关节炎（OA）是一种以软骨退化、钙化、软骨下骨硬化和滑膜炎症为特征的关节疾病，导致关节间隙变窄、疼痛和功能丧失[1,2]。滑膜组织和关节软骨中含钙晶体的沉积和积累与OA有关[3]。与没有显著晶体沉积的OA患者相比，体内有钙晶体的患者表现出更快速和严重的疾病进展[4,5]。在OA患者的受影响软骨、半月板组织和/或滑液中发现的含钙晶体主要是碱性磷酸钙（BCP）[3,6]。BCP晶体主要由三钙磷酸盐Ca₃(PO₄)₂、羟基磷灰石Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂和八钙磷酸盐Ca₈(HPO₄)₂(PO₄)₄·5H₂O组成，它们的摩尔Ca:P比分别为1.67、1.33和1.50[7]。BCP晶体的存在与疾病进展加快和严重程度增加相关，表明这些晶体可能参与了疾病过程[8]。然而，早期OA期间可能已经形成的纳米级含钙晶体的现象尚未得到充分关注，其沉积机制及其对周围细胞的影响也尚未完全明了。

含钙晶体的形成是一个活跃的、高度调控且复杂的生物过程，主要由软骨细胞启动，并受到遗传因素、肥大、自噬或炎症和衰老反应的影响[9,10]。衰老已被广泛认为是OA发展的重要风险因素。然而，目前尚不清楚基于遗传变异的不同亚型患者中，衰老表型与BCP晶体沉积之间的关联是否具有特异性。也不清楚衰老是否是软骨细胞与BCP晶体直接或间接相互作用的结果。先前的研究表明，BCP晶体会附着在细胞表面的蛋白质上，这使得难以区分晶体本身产生的效应与细胞表面涂层蛋白质引起的效应[11]。BCP晶体还可以与细胞因子（如白细胞介素（IL）-6）相互作用，对软骨产生氧化应激[12]。现有研究还表明，钙离子沉积与铁死亡密切相关[13,14]。此外，钙调蛋白可能通过调节铁死亡来降低细胞线粒体功能[15]。作为微米级晶体，BCP晶体可能会物理性地干扰细胞膜或细胞器膜，从而触发导致氧化还原失衡的损伤反应途径。尽管目前没有直接证据表明BCP晶体的形成与铁死亡有关，但这一现象可能成为延缓OA进展和对抗衰老的潜在治疗靶点。由于BCP是病理关节炎中的重要钙晶体，它很可能与钙离子、钙化、氧化应激和铁死亡有关，这引起了我们极大的研究兴趣。

衰老的氧化还原（REDOX）假说认为，衰老会导致活性氧（ROS）的过度积累，从而破坏细胞信号传导、免疫反应、大分子运输和生理调节[16,17]。细胞经历形态变化、染色质重塑和代谢重编程，主要通过分泌促炎因子，这一过程被称为衰老相关分泌表型（SASP）[18]。随着衰老过程的进展，循环中的铁含量减少，而细胞内的铁储存增加，导致铁死亡或铁过载，由于氧化还原失衡引起铁死亡，这对细胞功能有害并促进衰老过程[19]。核因子红细胞2相关因子2（NRF2）是一种调节抗氧化基因表达的关键蛋白，它与特定抗氧化基因启动子区域的抗氧化反应元件结合[20]。铁死亡是一种非凋亡性的细胞死亡形式，由磷脂过氧化物的致命积累引起，这是由于细胞抗氧化防御系统（特别是谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）轴）的失效。这一过程的特点是铁催化的脂质过氧化过程超过细胞的还原能力，导致膜损伤和细胞死亡[21,22]。GPX4在通过将磷脂过氧化物还原为脂醇来抑制铁死亡方面起着关键作用，这一过程依赖于还原型谷胱甘肽。研究表明，全身铁过载和细胞内铁积累会在动物模型中诱导和加重OA[23,24]。多项研究已在OA中检测到铁死亡的存在，并指出GPX4是该疾病的关键调节因子[25]。虽然BCP晶体在OA中起重要作用，但关于铁死亡途径的激活及其对ROS诱导的OA的贡献的研究尚未报道。此外，值得探讨的是BCP晶体是否通过增加ROS水平来加剧铁死亡，从而进一步加速与软骨细胞衰老相关的OA进展。

未来治疗策略的最有希望的目标是诊断BCP晶体的形成或更深入地研究关节囊内的BCP信号转导级联反应。本研究旨在探讨合成BCP晶体在促进软骨细胞中ROS产生和铁死亡进展中的作用，并探索其与软骨细胞衰老相关的OA的贡献。此外，还研究了BCP晶体和GPX4抑制剂RSL3对大鼠模型膝关节衰老的影响，以了解BCP晶体如何通过抑制GPX4-NRF2通路来增强铁死亡，为潜在的OA治疗方法提供新的见解。

试剂和抗体

试剂由Hushi公司（中国上海）提供，包括CaCl?、NaOH、Na2HPO4和NaH2PO4。SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）测定试剂盒、MitoTracker Red CMXRos、含有JC-1的线粒体膜电位测定试剂盒和Cell Counting Kit-8（CCK-8）来自Beyotime Biotechnology（中国上海）。胎牛血清和青霉素/链霉素来自Gibco BRL（美国马里兰州）。基质金属蛋白酶（MMP）-3（#17873-1-ap）和细胞肿瘤抗原P53（P53）

GPX4下调和铁死亡与软骨细胞衰老相关

通过对GEO和GO富集分析的人类基因库数据集GSE114007的分析，发现参与铁死亡调节的基因与OA的发生显著相关（图1A）。此外，GO基因富集分析显示氧化应激在人类OA的进展中起着关键作用（图1B, C）。在该数据库的生物信息学分析中，当LogFC < -0.8且p值<0.05时，GPX4在人类OA患者中显著下调（图1D）

讨论

为了阐明BCP晶体诱导的铁死亡在膝关节软骨衰老和退化中的作用，采用了体外和体内方法。研究结果表明，BCP晶体通过促进脂质过氧化和线粒体功能障碍来破坏氧化还原平衡并触发铁死亡，从而加速软骨细胞衰老。GPX4-NRF2通路被确定为这一过程中的关键调节通路，这突显了其作为治疗靶点的潜力

结论

总体而言，本研究提供了有力证据，表明BCP晶体的沉积通过诱导铁死亡和细胞衰老促进了OA的发展和发病机制。具体而言，BCP晶体介导的GPX4下调在OA进展中起着多重作用：[1] 促进氧化应激和铁死亡；[2] 通过GPX4-NRF2信号通路调节ECM和软骨下骨的降解；[3] 增强脂质过氧化，导致软骨细胞衰老

资助

该项目得到了国家自然科学基金（项目编号：82272528）、湖北省自然科学基金（项目编号：2022CFB117）和中央高校基本科研业务费（项目编号：2042025YXA007）的资助。

数据和材料的可用性

本研究生成的数据可应要求提供给相应作者。

伦理批准和参与同意

本研究获得了武汉大学人民医院动物护理和使用委员会（WDRM20220603C）以及武汉大学人民医院伦理委员会（2022-K224）的批准。

患者发表同意

不适用。

CRediT作者贡献声明

周彦：撰写——初稿，项目管理，概念构思。张彦涛：撰写——初稿，软件，资源。朱振星：撰写——审阅与编辑，监督，概念构思。纪培瑶：软件，资源，方法学。吴宇阳：验证，软件，资源。明江华：方法学，正式分析，数据管理。

数据可用性

生物信息学分析中使用的基因矩阵来自GEO公共数据库，数据编号为

CRediT作者贡献声明

张彦涛：撰写——初稿，软件，资源。朱振星：撰写——审阅与编辑，监督，概念构思。纪培瑶：软件，资源，方法学。吴宇阳：验证，软件，资源。明江华：方法学，正式分析，数据管理。周彦：撰写——初稿，项目管理，概念构思。