《Cell Calcium》：A NOX2-independent mechanism of Hv
1 channel activation promotes inflammatory cytokine release from BV-2 microglia via intracellular Ca2+ mobilisation
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本研究通过分子对接、动态模拟和生物层干涉实验证实S-023-0515直接激活微胶质Hv1.1通道，引发细胞内pH碱化和Ca2?动员，其机制依赖SERCA泵而独立于NOX2，最终激活NF-κB通路导致炎症因子释放和神经毒性。
阿舒托什·夏尔马（Ashutosh Sharma）|普里扬卡·亚达夫（Priyanka Yadav）|希瓦尼·亚达夫（Shivani Yadav）|维卡什·库马尔（Vikash Kumar）|昆瓦尔·拉文德拉·辛格（Kunvar Ravendra Singh）|玛德哈维·拉纳瓦特（Madhavi Ranawat）|希瓦尼·帕尔（Shivani Pal）|安基塔·亚达夫（Ankita Yadav）|戈库尔·克里希南·纳根德拉恩（Gokul Krishnan Nagendran）|苏尼尔·P·卡塞（Sunil P. Kase）|亚杜文德·亚达夫（Yaduvender Yadav）|萨蒂什·K·穆德德拉（Satish K. Mudedla）|瓦尔米克·S·辛德（Valmik S. Shinde）|阿拉文德·辛格·克沙特里（Aravind Singh Kshatri）
印度勒克瑙中央药物研究所（CSIR-CDRI）神经科学与衰老生物学部门，邮编226031
摘要
小胶质细胞是感知和应对大脑中所有病理事件的主要免疫细胞。电压门控质子通道（Hv1）特异性地表达在小胶质细胞中，以调节其细胞内pH值并维持氧化还原平衡。我们之前的研究表明，S-023-0515是一种新型的小胶质细胞Hv1通道激活剂，通过未知机制诱导神经炎症。在本研究中，我们利用分子对接、分子动力学（MD）模拟和生物层干涉测量（BLI）技术证明了S-023-0515与Hv1通道的直接结合。S-023-0515处理可导致细胞内持续碱化，进而使胞质Ca2+水平逐渐升高。主要质膜Ca2+离子通道（如TRPV1、Cav1.2、ASIC和P2×7）以及细胞内Ca2+释放通道均未参与S-023-0515诱导的Ca2+升高。这种Ca2+的动员是通过肌质/内质网Ca2+ATP酶（SERCA）实现的，因为抑制SERCA会消除S-023-0515介导的Ca2+升高。Hv1介导的Ca2+信号进一步促进了NF-κB的激活，导致BV-2小胶质细胞中促炎细胞因子（如TNF-α和IL-1β）的稳定增加，表现出炎症性小胶质细胞表型。值得注意的是，这种促炎反应完全归因于Hv1通道的激活，因为S-023-0515处理后NOX2的激活或局部细胞pH值均未改变。这些发现表明，独立于NOX2的Hv1通道激活会触发Hv1-SERCA-Ca2+-NF-κB信号级联反应，破坏细胞内Ca2+平衡并导致小胶质细胞神经毒性。
引言
维持离子浓度和细胞内pH值的平衡是任何活细胞的基本任务。在中枢神经系统（CNS）的小胶质细胞静息状态下，代谢产生的H+与Na+/H+交换器（NHE1）之间的动态相互作用使它们能够将pH值维持在生理范围内（约7.2-7.4）[1]。电压门控质子通道（Hv1）也主要表达在小胶质细胞中，在炎症刺激下，Hv1通道被激活并将质子排出细胞外，以对抗NOX2引起的酸化并维持细胞内pH值接近生理值[2]。与此观点一致，Hv1通道的激活和抑制分别导致细胞内碱化和酸化[3, 4]。在持续的神经炎症过程中，过度的NOX2依赖性Hv1活性被认为会促进氧化应激和促炎细胞因子信号传导，从而导致神经元损伤[5, 6]。根据这些发现，药理学阻断Hv1通道可以抑制NOX2依赖性的ROS产生和细胞因子分泌，从而减弱小胶质细胞的激活[6, 7, 8]。尽管Hv1通道通常被视为NOX2依赖性蛋白，但新的证据表明它们也具有独立于NOX2的功能。例如，精子中的Hv1通道可以独立于NOX2活性介导质子排出，从而实现细胞内碱化[9]。这些发现扩展了Hv1通道的生理功能，超出了其在ROS调节中的传统作用。
钙信号传导是小胶质细胞的另一个关键调节因子，控制着它们的静息（监视）和激活（炎症或修复）功能[10, 11]。在基础静息状态下，小胶质细胞内的钙水平相对于细胞外环境保持较低浓度。这种平衡主要通过多种细胞钙调节机制的协同作用实现，包括质膜Ca2+ATP酶（PMCAs）和Na+/Ca2+交换器，它们将Ca2+从细胞质中排出[12, 13]。此外，Ca2+还通过肌质/内质网Ca2+ATP酶（SERCA）和线粒体Ca2+单向转运蛋白（MCU）在内质网（ER）和线粒体内进行隔离[14, 15]。小胶质细胞的细胞外信号传导可以通过Ca2+通透性通道的流入或从内质网Ca2+储存库的动员显著提高细胞内Ca2+浓度[16, 17, 18]。
最近，我们使用一种新的激活剂S-023-0515验证了BV-2小胶质细胞的Hv1通道功能[19]。除了作为理解激活小胶质细胞中Hv1通道生理功能的药理学工具外，该分子还展示了Hv1通道（独立于NOX2）对小胶质细胞信号传导和炎症的内在能力。用S-023-0515处理小胶质细胞会触发许多与炎症相关的标志物，包括小胶质细胞M1样极化的增加、促炎介质的产生、吞噬能力的增强、线粒体ROS水平的提高以及NF-κβ通路的上调，从而引发神经毒性[19]。然而，S-023-0515激活Hv1导致小胶质细胞炎症的细胞机制尚未明确。
在这项工作中，我们旨在阐明S-023-0515激活Hv1通道的分子和细胞机制以及BV-2小胶质细胞的促炎表型。通过分子对接分析、MD模拟和BLI，我们首先证明了S-023-0515与Hv1通道的直接结合。此外，通过荧光动力学测量和活细胞pH/Ca2+成像，我们发现S-023-0515诱导的Hv1激活会导致细胞内持续碱化和胞质Ca2+水平逐渐升高。这种Ca2+的动员独立于经典的质膜Ca2+通道和IP3或瑞诺丁受体介导的释放，但可以通过抑制SERCA泵来消除。最后，S-023-0515处理激活了NF-κB，导致促炎细胞因子（如TNF-α和IL-1β）的时间依赖性表达，符合炎症性小胶质细胞表型。
BV-2小胶质细胞在含有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM/F-12培养基中培养，并在37°C、5% CO2的湿润培养箱中保存。所有实验中，传代5-20之间的细胞以1-2×10^5/ml的密度接种。实验前，细胞被接种到96孔板上并允许其粘附12小时。对于电生理学实验，细胞被接种在经过聚L-赖氨酸处理的12毫米玻璃盖片上。
S-023-0515与Hv1通道结合的结构和生物物理特性
为了研究S-023-0515与Hv1通道的结合，我们将分子对接与实时生物层干涉测量（BLI）分析相结合。对接预测S-023-0515结合在闭合的Hv1通道的一个口袋内（PDB: 3WKV），该口袋由Ile154、Val174、Arg204、Arg207和Gly211包围，这些残基共同稳定了配体结合（图1A，左侧）。这些残基直接参与相互作用网络，如2D相互作用图所示，其中涉及氢键和疏水性相互作用...
像小胶质细胞这样的免疫细胞需要严格控制细胞内pH值以发挥其最佳功能。Hv1通道是小胶质细胞中重要的质子调节机制之一，在pH值稳态[45]、膜电位维持[46]和小胶质细胞激活[47]中起着关键作用。小胶质细胞介导的炎症反应，如增殖、迁移、分支、去分支以及NO、促炎细胞因子和BDNF的释放，也需要...
本工作得到了SERB-启动研究基金（授权号：SRG/2023/000038，授予A. Kshatri）、Ignite生命科学基金会（授权号：IGNITE/CANDO-ETR/2023/002，授予A. Kshatri）、CSIR-HCP（532501）以及CSIR、DBT和UGC的奖学金资助。
夏尔马（Sharma）负责概念化、研究、正式分析、编辑草稿和可视化。亚达夫（Yadav）和帕尔（Pal）进行了研究并进行了正式分析。库马尔（Kumar）和拉纳瓦特（Ranawat）也进行了研究并进行了正式分析。穆德德拉（Mudedla）进行了研究并进行了正式分析。
阿舒托什·夏尔马（Ashutosh Sharma）：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析、数据整理、概念化。
普里扬卡·亚达夫（Priyanka Yadav）：研究、正式分析。
希瓦尼·亚达夫（Shivani Yadav）：研究、正式分析。
维卡什·库马尔（Vikash Kumar）：研究、正式分析。
昆瓦尔·拉文德拉·辛格（Kunvar Ravendra Singh）：撰写——原始草稿、研究、正式分析。
玛德哈维·拉纳瓦特（Madhavi Ranawat）：...
希瓦尼·帕尔（Shivani Pal）：研究、正式分析。
安基塔·亚达夫（Ankita Yadav）：研究、正式分析。
戈库尔·克里希南·纳根德拉恩（Gokul Krishnan Nagendran）：...
