《Cellular Signalling》：NR4A1 attenuates neuroinflammation after spinal cord injury by modulating microglial polarization via negatively regulating the VAV1 pathway
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脊髓损伤中NR4A1通过抑制VAV1信号通路调控小胶质细胞极化，减轻神经炎症，为治疗提供新靶点。
Ning Qu|WenJie You|LingLi Gong|KaiYun Wang|Qi Shu|LuoLong Tao|YanLong Zhong|QiHua Qi|Wei Zuo
中国江西省南昌市南昌大学第一附属医院骨科
摘要
脊髓损伤（SCI）是一个全球性的健康问题，可能导致严重的神经功能障碍。NR4A1在面对多种刺激时会迅速被激活，并在中枢神经系统（CNS）中发挥多种重要作用。然而，其在脊髓损伤中的具体功能机制尚不明确。
本研究发现在小鼠挫伤性脊髓损伤模型中，微胶质细胞的NR4A1表达显著下调，同时伴随着VAV1和促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表达增加。使用胞孢霉素B（Csn-B）处理可以降低VAV1的表达，减轻炎症反应，缩小损伤面积，并改善脊髓损伤小鼠的运动功能。进一步分析表明，Csn-B促进了微胶质细胞从M1型向M2型的极化，同时减少了TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。相反，给予DIM-C-pPhOH（C-DIM8）则产生了完全相反的效果。在体外实验中，通过用LPS（200 ng/ml，24小时）刺激BV2微胶质细胞建立了模拟体内脊髓损伤的模型。进一步的机制研究表明，NR4A1的过表达可促使BV2细胞从M1型向M2型极化，并抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的释放；而NR4A1的敲低则使BV2细胞从M2型向M1型极化，并增强TNF-α、IL-1β和IL-6的释放。进一步的研究证实NR4A1直接作为VAV1的转录抑制因子。敲低或过表达VAV1可以分别逆转NR4A1对LPS刺激的BV2细胞的影响。
总体而言，本研究表明NR4A1通过调节微胶质细胞的极化来缓解脊髓损伤引起的神经炎症。针对NR4A1-VAV1轴可能是治疗脊髓损伤的有希望的治疗靶点。
引言
脊髓损伤（SCI）是一种全球性的健康问题，可能导致永久性的运动、感觉和自主神经功能障碍[1]。全球约有300万脊髓损伤患者，每年新增病例约25万至50万例[2]。尽管脊髓损伤显著降低了患者的生活质量，并给家庭和社会带来了沉重的医疗负担，但目前尚无有效的治疗方法。
脊髓损伤的典型病理机制包括两个阶段：原发性和继发性损伤。原发性损伤是指由初始创伤引起的即时机械性损伤；继发性损伤由原发性损伤引发，涉及复杂的病理生理级联反应，如氧化应激、炎症、细胞凋亡、缺血、血脑屏障损伤和髓鞘脱失[3]。近年来，研究人员一直在探索脊髓损伤的病理机制和不同的治疗方法[4]、[5]、[6]、[7]。其中，炎症对损伤部位神经元和胶质细胞的细胞和分子变化有显著影响[8]。炎症反应在创伤后立即发生，可持续数月甚至数年[9]。炎症反应复杂且受多种细胞类型和炎症细胞因子的调节。早期的炎症反应对于清除病原体、细胞碎片和限制损伤程度非常重要；然而，过度的炎症反应可能导致严重的神经功能障碍[10]。作为一种动态且可逆的病理生理过程，炎症反应已成为脊髓损伤治疗研究的关键靶点。
微胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，约占所有CNS细胞的10%[11]。它们是首先对病理变化作出反应的细胞，脊髓损伤后的炎症主要由微胶质细胞介导[12]。根据损伤部位的微环境刺激，微胶质细胞可以极化为促炎型M1型或抗炎型M2型[13]。M1型微胶质细胞的过度激活会持续释放促炎因子，加剧神经损伤；而M2型极化则通过分泌抗炎因子促进修复并有助于运动功能的恢复[13]、[14]。
NR4A1（核受体亚家族4，A组，成员1）属于Nur核受体家族的转录因子，其在小鼠的脑和脊髓组织中稳定状态下高表达，尤其是在Iba1+微胶质细胞中[15]。NR4A1在中枢神经系统（CNS）中具有多种重要功能，主要包括神经保护、炎症调节和神经元可塑性。先前的研究表明，NR4A1可以调节微胶质细胞的极化，并保护多巴胺能神经元免受帕金森病中的炎症损伤[16]。另有报道指出，NR4A1激动剂胞孢霉素B（Csn-B）可以通过促进巨噬细胞/微胶质细胞向M2型极化来有效缓解多发性硬化症的炎症和髓鞘脱失[17]。此外，在大鼠脊髓损伤模型中，NR4A1基因表达在损伤部位前后45天内始终在脊髓的头部和尾部组织中下调[18]。尽管对NR4A1在中枢神经系统疾病中的作用进行了大量研究，但其在脊髓损伤中的具体功能，尤其是在调节微胶质细胞极化和炎症反应方面的作用仍不清楚。
VAV1是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），主要表达在人类造血细胞中，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤（NK）细胞、粒细胞和树突状细胞。它广泛参与调节细胞活化、分化、细胞因子产生、肌动蛋白聚合和细胞骨架重组。由于VAV1的表达主要限于造血细胞，研究表明靶向VAV1可以直接调节炎症反应，同时减少对非免疫细胞的影响[19]。先前的研究指出，VAV1是脊髓损伤中的关键免疫基因之一，与微胶质细胞的活化过程相关[20]、[21]。此外，在脑缺血/再灌注过程中，VAV1几乎仅存在于微胶质细胞中，沉默VAV1可通过抑制微胶质细胞的活化来减轻炎症和神经元凋亡[22]。对原代微胶质细胞的蛋白质组学分析表明，NR4A1可能是LPS诱导的微胶质细胞活化途径中的上游蛋白[23]。在本研究中，我们假设NR4A1在脊髓损伤中具有保护作用，其上调可通过促进微胶质细胞向M2型极化并抑制炎症来减轻损伤。
动物和治疗方法
健康的成年C57BL/6小鼠（雄性，体重约25克，6-8周龄）由SPF（北京）生物技术有限公司提供。这些小鼠在正常的实验条件下饲养（无特定病原体环境，12小时光照/黑暗周期，21-25°C，50-60%湿度，充足的饲料和水），每个笼子最多容纳五只小鼠。所有与动物相关的实验均遵循中国国家卫生研究院关于实验动物福利和使用的指南进行。
NR4A1在小鼠脊髓中的微胶质细胞中高表达，并可通过腹腔注射Csn-B和C-DIM8进行药理学调控
为了确定NR4A1在脊髓中的细胞定位，我们使用特异性抗体NeuN（神经元标记物）、GFAP（星形胶质细胞标记物）和Iba-1（微胶质细胞标记物）同时标记了主要类型的细胞。免疫荧光染色显示NR4A1在这三种类型的细胞中均有表达。此外，NR4A1与Iba-1标记的微胶质细胞高度共定位（图1A）。
为了验证腹腔注射Csn-B和C-DIM8的有效性，我们进行了Western blot实验。
讨论
原发性脊髓损伤不可避免且不可逆，因此目前的治疗策略主要集中在减轻继发性损伤引起的病理变化。炎症反应在决定损伤程度和恢复潜力方面起着关键作用[9]。研究表明，旨在减少脊髓损伤后炎症反应的治疗干预措施可以对神经功能恢复产生积极影响[27]。
据我们所知，
作者贡献声明
Ning Qu：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，项目管理，方法学设计，资金获取，数据分析，概念构思。WenJie You：撰写 – 审稿与编辑，方法学设计，实验研究，数据分析。LingLi Gong：撰写 – 审稿与编辑，实验研究，数据分析。KaiYun Wang：撰写 – 审稿与编辑，实验研究，数据分析。Qi Shu：撰写 – 审稿与编辑，实验研究，
资助
江西省自然科学基金（编号：20252BAC240484）支持了这项工作。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究结果。
