《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Dynamic linking bone ECM-mimic hydrogel for anti-inflammatory therapy of cranial defect
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颅骨缺损修复中，动态交联的HACys-VEGF@Coll-A水凝胶通过预先血管化微通道促进血管生成、骨再生及免疫调节，克服传统材料整合差、炎症反应强的问题。
陶戈|王宏才|邱梦梦|冯宽|史涛涛|李佳|杨世迪|陈茂松
浙江宁波大学附属立辉利医院神经外科，中国宁波315211
摘要
颅骨缺损修复常常受到内在再生能力有限、感染风险以及慢性炎症的阻碍，而传统的移植物和惰性植入物往往难以与宿主良好结合。本文介绍了一种模拟细胞外基质的水凝胶，通过动态的巯基-二硫键化学作用和牺牲性预血管化机制，同步促进血管生成、骨形成和免疫调节。将L-半胱氨酸乙酯（HACys）功能化的透明质酸与大蒜素交联，形成一种具有粘弹性且能缓解应力的网络结构，在该网络中，I型胶原被挤出成含有VEGF的微丝，作为牺牲性模板（HACys-VEGF@Coll-A）。这些微丝在酶的作用下分解，形成VEGF覆盖的微通道，引导血管快速生长。该复合材料与骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有优异的相容性，并能选择性地增强HUVEC的存活率和迁移能力。此外，含有VEGF的构建体显著促进了内皮管状结构的形成和迁移，同时上调了VEGF的mRNA表达，证实了其生物活性。在BMSCs中，含VEGF的水凝胶提高了碱性磷酸酶活性和矿物质沉积，同时上调了骨形成相关基因（ALP、COL1、RUNX2、OCN）的表达。值得注意的是，巨噬细胞的表型从CD86高/CD206低转变为CD86低/CD206高，TNF-α分泌减少而IL-10分泌增加，表明形成了有利于炎症消退的免疫微环境。总体而言，HACys-VEGF@Coll-A是一种动态的、可重塑的支架，既能整合预先形成的血管通道，又能支持骨形成并减轻炎症，从而解决了颅骨缺损修复的主要障碍，需要进一步进行体内评估，以研究其释放动力学、通道结构和力学性能。
引言
颅骨的固有再生能力有限，术后并发症（如感染、慢性炎症和愈合障碍）的风险较高，这一直是临床治疗的复杂挑战[1]、[2]、[3]、[4]。传统的颅骨缺损治疗方法，如自体移植、异体移植以及合成金属或聚合物植入物，在临床应用中较为普遍[5]、[6]、[7]。然而，这些方法存在显著局限性：自体移植和异体移植可能导致供体部位并发症和移植体积不足，异体移植还存在免疫排斥和疾病传播的风险，而且移植物的供应也是一个关键问题[8]、[9]。合成植入物通常与宿主组织的结合不良，感染率较高，炎症反应会进一步阻碍骨再生[10]、[11]、[12]、[13]。下一代材料应能在促进骨形成的同时，协调免疫反应，创造有利于组织再生的环境[14]、[15]。迫切需要开发出既能提供适当结构支持又能调节局部生物环境的下一代生物材料。
由于水凝胶具有良好的结构、可调的物理化学性质以及模拟细胞外基质（ECM）的能力[16]、[17]、[18]、[19]，在骨组织工程领域受到了广泛关注。ECM为周围细胞提供结构和生化支持，是调控细胞增殖、分化和迁移等过程的关键因素[20]、[21]。通过采用动态交联策略并对水凝胶进行生物活性分子的修饰，可以使其具备提供机械支持、引导细胞渗透以及实现治疗剂局部可控释放的功能。
尽管水凝胶具有巨大潜力，但传统水凝胶仍面临诸多挑战，尤其是营养和细胞渗透性受限，导致血管生成和组织再生不良，而这些因素对维持组织存活和整合至关重要[22]、[23]。水凝胶的高粘度和致密结构阻碍了细胞的深入渗透和新血管的形成[24]、[25]。
在本研究中，我们提出了一种基于骨ECM设计的动态交联水凝胶平台，专门用于颅骨缺损修复，以克服现有疗法的局限性（见图1）。该水凝胶不仅增强了骨形成活性，还具有免疫调节作用，可减轻过度炎症。具体而言，我们使用半胱氨酸偶联的透明质酸和大蒜素引入了巯基-二硫键动态连接机制，赋予水凝胶可调的物理化学性质。此外，我们还将含有VEGF的胶原微丝整合到复合材料中，以促进预血管化。这些微丝作为牺牲性模板，在植入后会被MMPs和其他酶快速降解，留下VEGF覆盖的微通道，引导血管生长。这种双重功能对于建立支持骨修复和组织整合的再生微环境至关重要。
材料
除非另有说明，所有用于材料合成的试剂均购自Aladdin Inc.（中国上海）。所有细胞培养基均购自Corning Inc.（美国纽约）。
水凝胶复合材料的制备与表征
在水环境中，通过透明质酸（HA）与L-半胱氨酸乙酯盐酸盐（Cys）之间的酰胺键反应，合成了L-半胱氨酸乙酯功能化的透明质酸（HACys）。首先制备了0.4%（m/V）的HA溶液（100毫升）。
HACys–VEGF@Coll-A的表征
扫描电子显微镜（SEM）显示，HACys–VEGF@Coll-A结构均匀且具有高度多孔性（图1A）。冻干后的基质呈现出典型的冰模板水凝胶特征，即开放、相互连接的孔网络，孔隙贯穿整个厚度，并伴有频繁的孔间连通（见补充视频）。这种拓扑结构有利于水分、代谢物和信号分子的快速传输，以及细胞的顺利渗透[27]。
结论
综合表征和体外功能实验表明，我们开发的动态交联HACys水凝胶（含有VEGF和牺牲性胶原微丝）构建体是一种新型的、模拟ECM的支架，适用于预血管化的骨再生。该材料具有多孔、相互连接的微结构，化学性质确认为非晶态且具有适应性。在功能上，该平台与细胞具有良好的相容性，能选择性地增强内皮细胞的存活率和迁移能力。
资助
本研究得到了以下资助：宁波市领先医学与健康学科项目（项目编号2022-F04）的支持。
CRediT作者贡献声明
陈茂松：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。杨世迪：软件开发、方法学设计。李佳：方法学设计、实验实施。史涛涛：软件开发、实验实施。冯宽：软件开发、方法学设计。邱梦梦：方法学设计、实验实施。王宏才：撰写、原始稿撰写、方法学设计、实验实施、数据管理。陶戈：撰写、原始稿撰写、方法学设计、实验实施、数据管理、概念构思。
