《Environmental Research》：Inflammatory responses and cilia reorganization induced by daily exposure to diesel exhaust particles in primary human nasal epithelium
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本研究探讨低剂量柴油颗粒物（DEPs）长期每日暴露对原代人类鼻上皮细胞（PHNE）发育和成熟的影响。通过ALI培养和蛋白质组学分析，发现早期阶段DEPs暴露触发炎症反应，后期主要影响纤毛组装和运动。结果揭示了DEPs通过调控炎症和纤毛功能参与鼻上皮发育调控的新机制。
韩多贤|崔智贤|朴穆君|金娜贤|韩杜熙
韩国首尔国立大学医院生物医学研究所蛋白质组学核心设施
摘要
柴油尾气颗粒（DEPs）是空气颗粒物（PM）的主要成分，与急性和慢性上呼吸道炎症性疾病的发展密切相关。我们研究了长期每日暴露于低剂量DEPs对原代人鼻上皮（PHNE）发育和成熟的影响，以阐明可能介导DEPs诱导的炎症反应或疾病发病机制的新机制。在气液界面（ALI）条件下培养的PHNE从第1天到第23天每天暴露于0.5 μg/cm2的DEPs中5小时。随后在第6天、第12天和第24天收集PHNE细胞样本，并使用基于质谱的同位素标记定量蛋白质组学和生化分析方法进行检测。共鉴定出7,993种蛋白质，其中约有一半在PHNE成熟过程中表现出时间依赖性的差异表达模式。为了确定在DEPs暴露下差异表达的蛋白质，我们在每个时间点进行了配对t检验。对这些差异表达蛋白质的功能注释聚类分析显示，在第6天富集了与炎症反应相关的基因本体（GO）术语。到第24天时，与纤毛相关的多个GO生物过程（GO-BP）术语（如纤毛组装、纤毛内运输和纤毛运动）显著富集。我们的研究结果表明，长期每日暴露于低剂量DEPs可以在PHNE成熟早期触发炎症反应，并在后期主要通过干扰纤毛组装和运动来影响纤毛生成。
引言
近年来，空气污染已成为对人类健康最严重的威胁之一。柴油尾气颗粒（DEPs）主要由柴油发动机车辆产生，是直径小于2.5 μm的空气颗粒物（PM）的主要成分（Steiner等人，2016年）。在动物模型中的各种实验研究、体外模型中对DEPs高剂量效应的研究以及人类的流行病学研究都提供了强有力的证据，表明DEPs对人体健康和疾病（尤其是炎症性疾病和致癌作用）有显著影响。我们之前的研究表明，急性暴露于高剂量DEPs会降低原代人鼻上皮细胞的上皮屏障功能，并下调连接分子（如occludin、ZO1、claudin1和E-钙黏蛋白）的表达（Kim等人，2019年）。此外，这种急性高剂量暴露还会诱导与肿瘤发生相关的多种分泌蛋白的差异表达，包括参与细胞存活和凋亡的蛋白质（Kim等人，2022年）。然而，长期低剂量DEPs暴露对鼻上皮分化和成熟的累积效应仍知之甚少。
鼻上皮主要由纤毛细胞和分泌黏液的杯状细胞组成。这些细胞通过自我更新从基底细胞生理分化而来。这种黏液纤毛上皮作为呼吸道的第一个屏障，抵御环境中的病原体。黏液纤毛清除是一个严格调控的过程，通过协调和有节奏的纤毛运动将滞留在呼吸道黏液层中的病原体排出（Adivitiya等人，2021年）。
原代人鼻上皮（PHNE）可以通过在气液界面（ALI）培养PHNE细胞来体外形成，从而实现完全的黏液纤毛分化。由于其原始来源和三维培养特性，PHNE细胞能够准确反映体内上皮情况，并可被控制性地刺激以监测其反应。在本研究中，从第1天到第23天，培养在ALI中的PHNE每天暴露于低剂量DEPs中。然后使用基于质谱的无标记定量蛋白质组学、免疫荧光染色和生化分析方法分析了不同成熟阶段的PHNE总蛋白含量。
患者样本的获取
PHNE细胞从患者的正常鼻组织（远离明显病变区域，如覆盖鼻腔钩突的组织）中分离获得（非过敏个体：两名29岁和40岁的女性以及两名36岁和41岁的男性），这些患者正在进行选择性鼻外科手术。所有样本的收集均遵循机构审查委员会（IRB）批准的方案，并获得了书面知情同意。本工作已获得批准。
发育中的PHNE细胞中DEPs特异性蛋白质的表达动态
从3名供体的PHNE细胞中提取总蛋白，并使用质谱进行定量蛋白质组学分析（补充图1）。简要来说，从第1天、第6天、第12天和第24天的ALI中各获取36个上皮蛋白样本（n = 3），使用Filter-Aidd Sample Preparation（FASP）方法将其消化成肽段，并在4次TMT实验中进行TMT10-plex标记，每次实验包括一个用于跨运行标准化的参考样本。TMT标记的肽段样本随后被分离
讨论
在关于DEPs的实验研究中，浓度和暴露强度通常超过现实环境水平——有时高达1000倍。这种差异可能导致低估了DEPs暴露的实际风险和健康影响。为了解决这一问题，我们在一个旨在紧密反映实际情况的体外模型中研究了长期每日暴露于低浓度DEPs对原代人鼻上皮（PHNE）分化过程的影响
结论
直到第24天的每日低剂量DEPs暴露不会损害紧密连接的完整性或诱导PHNE发育过程中的明显EMT信号通路。然而，它在体外对PHNE分化具有累积效应，这体现在整个成熟过程中蛋白质表达和相关信号通路的动态变化上。这些变化主要影响早期阶段的炎症反应和后期阶段的纤毛生成。
CRediT作者贡献声明
韩多贤：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、研究、数据分析、概念化。崔智贤：验证、方法学、研究。韩杜熙：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、数据分析、概念化。朴穆君：撰写 – 审稿与编辑、资源准备。金娜贤：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督、项目管理、资金支持伦理声明
本工作已获得首尔国立大学医学院和首尔国立大学医院IRB的研究伦理批准（编号2012-011-1177），如需可提供批准证明/证书。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）（由韩国政府MSIT资助）（NRF-2020R1F1A1065979）、首尔国立大学医院研究基金（0420230230）以及韩国疾病控制与预防中心的研究基金（2021ER120300）的支持。
