氧化还原失衡和NF-κB激活驱动草鱼（Ctenopharyngodon idella）中1,3-二苯胍（DPG）引起的肝毒性：HSP70作为保护性治疗靶点

《Environmental Research》：Redox Imbalance and NF-κB Activation Drives 1,3-diphenylguanidine (DPG)-Induced Hepatotoxicity in Grass Carp ( Ctenopharyngodon idella): HSP70 as a Protective Therapeutic Target

本研究通过草鱼实验揭示1,3-二苯基胍（DPG）肝毒性的分子机制，发现DPG暴露导致肝细胞凋亡（TUNEL阳性率增加2.46倍）、氧化应激（Nrf2通路无法缓解ROS积累）及自噬异常（伴随NF-κB炎症信号通路激活）。HSP70蛋白表达显著上调，其激动剂ML346可有效减轻炎症和凋亡。

　　

李思文|佘瑞静|林碧晓|李克曼|白阳|熊轩|刘兴超

中南大学湘雅公共卫生学院健康毒理学系，中国湖南省长沙市410013

摘要

1,3-二苯胍（DPG）作为一种广泛使用的橡胶硫化剂，已被证实对水生生物具有毒性。本研究阐明了DPG诱导的肝毒性的分子机制，并评估了潜在的治疗策略。实验中，暴露于DPG的草鱼表现出轻度至中度的肝水肿和窦状血管充血，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平分别升高了25.0%和46.3%。此外，DPG暴露后TUNEL阳性的肝细胞数量增加了2.46倍。RNA测序分析显示，促炎基因、自噬相关基因、氧化应激调节因子和热休克蛋白70（HSP70）的表达显著上调。同时，DPG暴露会引发肝脏氧化损伤，但核因子红系2相关因子2（Nrf2）通路激活无法对抗活性氧（ROS）的积累。进一步实验表明，DPG暴露会诱导核因子κB（NF-κB）介导的炎症和肝脏中的过度自噬。免疫组化和Western blot分析显示，DPG暴露后HSP70蛋白表达显著增加。Spearman相关性分析表明，DPG暴露后HSP70与炎症相关基因及血红素加氧酶-1（HO-1）之间存在正相关。体外实验表明，HSP70激动剂ML346能有效减轻肝细胞的炎症和凋亡。综上所述，DPG通过破坏氧化还原平衡、促进NF-κB介导的炎症和过度自噬发挥肝毒性作用。针对HSP70可能是减轻DPG诱导的肝脏损伤的有效策略。

引言

1,3-二苯胍（DPG）是皮革和塑料中广泛使用的二次促进剂，也是轮胎中可过滤有机物的主要来源（Santos和Snyder，2023年）。DPG是最常用的胍类衍生物，欧洲年产量为10,000至100,000吨（ECHA，2024年）。DPG主要通过橡胶产品制造过程中产生的废水和废弃产品的渗漏释放到环境中。值得注意的是，珠江三角洲地区的DPG浓度可高达58.78 μg/L（Zhang等人，2023年）。中国广东地区的地下水样本中，DPG检出率为99.5%，最高浓度达到1,859 ng/L（Zhang等人，2025b年）。美国米勒溪的城市水域中DPG浓度为0.018-0.87 μg/L，澳大利亚环境样本中为0.0013-1.1 μg/L（Johannessen等人，2021年；Peter等人，2020年）。降雨事件发生后，水系统中的DPG浓度通常会在几小时内达到峰值（Johannessen等人，2022年）。阿拉伯联合酋长国收集的洪水样本中DPG浓度范围为0.049至14.3 μg/L（Navarro Ramos等人，2025年）。DPG具有与含氮副产物相似的结构特征，可能表现出细胞毒性和遗传毒性。在淡水环境中，其与次卤酸的反应可能加剧生态毒性风险（Du等人，2025年；Xu等人，2024年）。因此，研究DPG对水生生物的急性毒性效应对于评估其在严重污染河流中的潜在生态风险至关重要。

研究表明，DPG暴露会干扰淡水水蚤多代种群的生长、繁殖和存活能力，同时降低其中和有害分子的能力（Yoganandham等人，2025年）。此外，暴露于DPG的斑马鱼死亡率更高，畸形率也更高，这突显了该化合物的负面发育影响（Domaoal等人，2025年）。DPG已被确定为合成橡胶手套中引起接触性过敏反应的过敏原（Dejonckheere等人，2019年）。DPG可通过降低斑马鱼胚胎存活率、增加畸形以及改变心脏和神经发育相关基因的表达来影响其发育（Xu等人，2025年）。暴露于含有DPG的轮胎磨损渗滤液会损害斑马鱼幼体的眼睛发育、游泳行为和趋光性（Chang等人，2023年）。轮胎磨损渗滤液在水生生物体内的生物累积明显，影响其胰岛素信号通路、肝细胞坏死和肝细胞索的消失，从而破坏生态平衡（Liu等人，2025年；Ni等人，2023年）。这种生态破坏会直接影响依赖水产养殖的经济系统，例如导致鱼类死亡、产量减少和养殖成本增加。由于DPG是危害水生生物的关键毒素，了解其对草鱼的影响对于保护水生生态系统和确保可持续水产养殖至关重要。

在生理条件下，自噬是维持水生生物基本细胞器更新的关键机制，其活性在环境压力下会动态上调（Li等人，2022a）。虽然基础自噬有助于维持细胞平衡，但其失调与胆汁淤积和纤维化等病理状态密切相关（Qian等人，2021年）。暴露于环境毒素时，选择性自噬可回收细胞质成分，从而维持生理活性（Wang等人，2022年）。含有DPG的轮胎磨损渗滤液会引发氧化应激反应，促进P. clarkii的自噬和凋亡通路（Liu等人，2025年）。值得注意的是，DPG会显著影响细胞线粒体生物能量代谢（如ATP产生和基础呼吸）。这种效应反过来又可以调节自噬过程（Marques等人，2022年；Pesonen等人，2019年）。然而，现有研究表明，自噬在鱼类中具有双重作用，既影响抗感染免疫，又影响肝脏代谢和肌肉生长（Zhou等人，2022年）。此外，环境污染物可激活鲤鱼淋巴细胞中的过度自噬，导致细胞死亡（Yang等人，2020年）。因此，阐明DPG对水生生物自噬的影响将为理解其生态毒性提供关键见解。

促炎细胞因子作为激素信使，介导大多数免疫系统的生物学效应（Yin等人，2023年）。急性肝损伤的病理生理异质性可引发先天免疫失衡，破坏结构完整性与功能能力之间的平衡。在此过程中，核因子κB（NF-κB）在保护和致病过程中起核心作用，诱导促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达，形成正反馈调节环路（Verboom等人，2021年；Cao等人，2022年）。此外，NF-κB的激活与环境毒素诱导的凋亡和自噬的启动和进展有关（Wang等人，2022年）。NF-κB与自噬细胞死亡通路的相互作用会增强促炎基因的表达（Hwang等人，2010年；Wang等人，2024年）。NF-κB的激活还与下游信号传导通路相互作用，导致代谢失调和趋化因子的分泌，从而招募巨噬细胞。这种级联反应会增加肝细胞损伤、纤维化和肝细胞癌的风险（Luedde和Schwabe，2011年；Capece等人，2022年）。因此，NF-κB介导的炎症可能是预防和治疗肝损伤的潜在治疗靶点。

热休克蛋白（HSPs）被认为是环境压力下参与解毒防御机制的应激诱导分子伴侣（Gao等人，2022年）。作为分子伴侣，HSPs可以促进新生多肽的折叠或解折叠，修复受损的分子结构，并介导受损蛋白质分子的降解。越来越多的证据表明，在环境诱导的细胞压力下，HSPs的表达会增加，通常伴随着宿主免疫抑制，从而延续免疫抑制的循环（Banerjee等人，2015年）。HSP70在暴露于各种环境压力的扇贝中可作为多基因生物标志物（Li等人，2025年）。值得注意的是，HSP70通过与共激活蛋白和靶蛋白形成稳定的蛋白质相互作用来维持细胞稳态。然而，抑制HSP70可以减轻斑马鱼中双酚AF诱导的氧化应激和炎症损伤（Zhang等人，2025a）。此外，在Orthetrum albistylum幼体中，重金属压力下HSP70的表达模式不同（Ma等人，2024年）。抑制HSP70可以减轻斑马鱼血管内皮中的Cd诱导损伤（Zhang等人，2023年）。最近的研究表明，NF-κB介导的免疫调节与水生生物中的HSP反应之间存在密切关系（Kumar等人，2021年）。因此，阐明DPG暴露对水生生物热休克反应的影响对于它们的保护至关重要。

本研究使用了与环境相关的DPG浓度，以阐明DPG在草鱼（Ctenopharyngodon idella）中诱导的肝毒性的分子机制，并探索潜在的干预策略。我们的研究确定了DPG引发的关键损伤信号：氧化损伤、NF-κB介导的炎症和肝脏中的过度自噬。这些发现不仅加深了对DPG生态毒理效应的理解，还为制定更严格的环境水质标准、优化工业排放管理和开发生态恢复技术提供了科学基础。

实验部分

动物与处理

从四川的一家商业水产养殖场获得了40条健康的雄性草鱼（Ctenopharyngodon idella），平均体重为15.20 ± 0.2克，在实验前已在实验室条件下适应了7天。为了评估DPG（cas: 102–6-7）的生态毒性效应，采用了分阶段暴露方案，包括与环境相关的浓度以及用于机制研究的较高剂量。

DPG暴露改变了草鱼的肝脏形态并诱导肝细胞死亡

在本实验中，对照组和DPG组之间的体重没有显著差异（图1A）。组织学染色显示，DPG暴露导致肝细胞膨胀、脂肪变性、水肿和染色质浓缩（图1B）。同样，DPG组的肝脏组织学评分低于对照组（图1C）。此外，DPG暴露后血清ALT和AST水平分别升高了25.0%和46.3%

讨论

我们的研究发现，DPG暴露会在草鱼的肝脏中诱导过度自噬体的形成和凋亡。同时，DPG暴露会导致肝脏氧化损伤，但Nrf2通路的激活无法抵消过量的ROS积累。此外，我们发现NF-κB驱动的炎症参与了DPG引起的肝脏损伤。同时，我们发现HSP70激动剂可以减轻肝细胞凋亡和炎症反应

结论

研究表明，与环境相关的DPG浓度会在草鱼肝脏中诱导NF-κB介导的炎症和过度自噬，这是由于ROS过度积累所致。DPG暴露还会损害肝脏抗氧化酶的活性，而Nrf2通路的激活不足以缓解ROS的过度产生。体外实验表明，HSP70激动剂能有效减轻L8824草鱼中DPG诱导的凋亡和炎症反应

CRediT作者贡献声明

白阳：数据可视化、验证、资源管理、数据整理。熊轩：监督、软件使用、方法学设计、概念构建。刘兴超：撰写——审稿与编辑、项目管理、数据整理、概念构建。李思文：初稿撰写、软件使用、实验设计、资金申请、数据分析、数据整理、概念构建。佘瑞静：数据可视化、验证、软件使用、方法学设计、实验设计。林碧晓：数据可视化

未引用的参考文献

Li等人，2023年；Liu等人，2025年；Pesonen和V?h?kangas，2019年；Wang等人，2022年；Wang等人，2024年；Wang等人，2024年；Zhang等人，2023a年。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢长沙自然科学基金（编号：Kq2502043）和湖南省自然科学基金青年项目（编号：2025JJ60520）的支持。