EPS重组对硝化污泥中头孢唑肟命运的影响：降解途径、微生物适应性及毒性降低

《Environmental Research》：EPS restructuring–linked fate of ceftizoxime in nitrifying sludge: degradation pathways, microbial adaptation and toxicity reduction

硝化系统对第三代头孢菌素ceftizoxime（CEX）的响应机制研究。通过四组序批式反应器（5-20 mg/L CEX）连续运行175天，发现硝化效率随CEX浓度升高而降低，但中低浓度下可通过EPS蛋白富集和微生物群落适应实现功能恢复。LC-MS/MS解析出β-内酰胺环水解、脱羧及碳链断裂三条降解路径，产物毒性经大肠杆菌生物测定验证显著降低。EPS层分布研究揭示：S-EPS富集亲水性低毒产物，LB-EPS/ TB-EPS积累疏水性母体药物，其重构过程与硝化菌（Nitrosomonas 1.4%-8.8%，Nitrospira 0.1%-3.2%）丰度变化及CEX降解同步性密切相关。

　　

唐志强|刘洪|罗杰|王晓霞|陈永志

兰州交通大学环境与市政工程学院，中国兰州730070

摘要

关于抗生素如何影响硝化系统的系统理解——将去除途径、降解产物的毒性以及微生物群落的变化联系起来——仍然有限。在本研究中，四个实验室规模的序批反应器运行了175天，用于处理添加了第三代头孢菌素头孢噻肟（CEX）的生活污水，浓度分别为5、10、15和20毫克/升。硝化污泥表现出功能恢复，氨的去除效率分别稳定在84.1%、72.4%、45.5%和39.4%。同时，随着进水浓度的增加，CEX的去除效率从97.2%下降到43.7%，但仍与硝化性能保持正相关；当CEX浓度≤10毫克/升时，它完全转化为无毒或低毒性的产物。CEX的压力影响了胞外聚合物物质（EPS）：总EPS增加，其组成向蛋白质主导转变，PN/PS比率从1.03上升到2.13。相分离测量显示CEX在水相、EPS组分（S-EPS/LB-EPS/TB-EPS）和细胞内相之间存在明显的分离，而EPS层特异性的LC–MS/MS指纹支持了EPS层逐步转化的解释。微生物群落分析显示氨氧化细菌（如Nitrosomonas）显著减少（从8.8%降至1.4%），亚硝酸盐氧化细菌（如Nitrospira）也显著减少（从3.2%降至0.1%），同时与CEX压力条件相关的几个异养菌属（如Ferruginibacter、Aquabacterium和Aquicella）富集。LC–MS/MS鉴定出三种CEX降解途径，首先是β-内酰胺环的水解，随后是脱羧和C-C键断裂，产生低分子量产物；而大肠杆菌的生物测定证实了在中等CEX浓度下的有效解毒作用。总体而言，这些结果阐明了EPS重组、微生物群落适应性和生物降解在减轻第三代头孢菌素对基于硝化的废水处理风险中的耦合作用。

引言

抗生素是广谱抗菌剂，会干扰病原体和有益微生物的生存和代谢，从而破坏微生物氮循环的关键过程（Yin等人，2017年）。第三代头孢菌素对革兰氏阴性细菌具有高活性，包括硝化微生物。因此，广泛使用的第三代头孢菌素头孢噻肟（CEX）预计会对硝化细菌产生比第一代头孢菌素更强的抑制作用，可能对生物氮去除（BNR）系统构成重大风险。由于30-90%的抗生素以原形或初级代谢物的形式排出，它们倾向于在污水处理厂（WWTPs）中积累，从而降低微生物的存活能力，减少功能性细菌的数量，并最终破坏BNR性能和出水质量（Sun等人，2024年）。一旦排放，含有抗生素的废水会扰乱水生生态系统，并促进耐抗生素细菌和耐药基因的传播。

目前的抗生素去除策略主要依赖于物理化学方法和生物处理（Li等人，2022b）。吸附过程利用天然或合成聚合物材料通过高表面积吸附剂上的物理相互作用或涉及共价或离子键的化学相互作用来保留抗生素（Arabkhani & Asfaram，2022；Chen等人，2022；Gahrouei等人，2024；Xiang等人，2019）。然而，吸附仅将抗生素从水中转移到固相，产生需要进一步处理的二次废物。高级氧化过程（AOPs）——包括光催化、基于臭氧的氧化和Fenton型反应——利用氧化剂和催化剂产生的高活性自由基来降解有机污染物（Cao等人，2024）。尽管AOPs可以高效分解抗生素，但它们非选择性地攻击可生物降解和难降解的有机物，导致高氧化剂消耗和运营成本（Ding等人，2020），并且可能产生比原化合物毒性更高的转化产物（Liu等人，2024a）。

生物过程仍然是大多数WWTPs的核心技术，其中生物降解和污泥相关的分配通常被认为是抗生素减量的重要机制（Zhu等人，2024）。在硝化相关系统中，据报道硝化菌群会在氨氧化条件下转化某些β-内酰胺类抗生素，AMO介导的共代谢被提出为一种可能的途径（Guo等人，2023；Li等人，2022a）。在混合活性污泥中，抗生素的减少通常与硝化菌和共存的异养菌以及胞外酶（如β-内酰胺酶）和污泥相关的保留过程有关（Nguyen & Oh，2023；Polesel等人，2016）。

胞外聚合物物质（EPS）在活性污泥对抗生素压力的响应中起着关键作用（Zhang等人，2018）。EPS由细菌、古菌、藻类和真菌分泌，主要由蛋白质和多糖组成（Wang等人，2022a）。蛋白质丰富的EPS含有疏水结构域和多种功能基团，有助于微污染物的富集，之后抗生素可以通过微生物酶进一步转化（J. Tang，2022）。活性污泥EPS通常分为可溶性EPS（S-EPS）、松散结合的EPS（LB-EPS）和紧密结合的EPS（TB-EPS）。这些层在细胞表面形成物理和化学屏障，并富含羧基、巯基、氨基、酚基和磷酸基等功能基团，可以与污染物相互作用（Vandana等人，2023）。低浓度的抗生素通常会诱导应激反应，刺激EPS的分泌，尤其是在抗生素抑制后系统恢复期间会消耗大量的蛋白质资源（Liu等人，2023a；Zhang等人，2019）。然而，第三代头孢菌素如CEX在硝化污泥中如何在S-EPS、LB-EPS和TB-EPS之间分配，以及这些EPS层之间的转化指纹有何不同，目前仍不清楚。

最近的证据表明，污泥EPS不仅仅是一个结构成分，还是控制抗生素吸附/结合的关键界面相，在某些情况下，它还控制着抗生素在微生物聚集体内的转化（Ben Hamed等人，2025）。EPS的组成（如富含蛋白质和多糖的组分）、功能基团和絮凝微结构可以共同调节抗生素的游离溶解（生物可利用）部分，从而缓冲急性暴露，同时影响在污泥中的长期接触和保留（Melo等人，2022；Zhao等人，2023）。这一概念框架为解释我们的相分离观察结果（水相与EPS组分）以及在持续CEX暴露下的EPS重组提供了重要基础。

β-内酰胺类抗生素的生物降解和转化通常由β-内酰胺环的水解开始，随后是脱羧和侧链断裂等反应，这些反应通常——但并不总是——会降低抗菌活性（Miao等人，2024；Timm等人，2019）。由β-内酰胺酶介导的酶促水解是主要的生物途径，而非生物水解和其他环境转化也可能根据条件发生（Bhattacharya & Khare，2022）。重要的是，转化产物（TPs）可能会持续存在，并可能保留生物活性或增加生态风险，这强调了将LC–MS/MS解析的TP指纹与毒性评估相结合的必要性，而不仅仅是依赖于原化合物的去除（Ge等人，2024；Sha等人，2025）。因此，将相分离的TP鉴定与毒性评估相结合，可以更全面地了解生物处理系统中的抗生素环境风险。

迄今为止，研究主要关注传统活性污泥中的第一代和第二代头孢菌素，而将CEX引起的硝化变化与EPS相关的分配/转化、微生物群落变化和残留毒性联系起来的综合证据仍然有限。在这里，我们使用头孢噻肟（CEX）这种代表性的第三代头孢菌素，来评估其对硝化SBRs的影响。选择5-20毫克/升的进水浓度，以代表富含抗生素的医院/制药/工业废水或对生物处理的偶发影响的高强度和/或冲击负荷条件，而不是背景市政进水。因此，本研究旨在：（i）量化剂量依赖性对AOB/NOB活性和硝化性能的影响；（ii）使用LC–MS/MS分析CEX及其转化产物在EPS组分（S-EPS、LB-EPS、TB-EPS）中的分布；（iii）分析群落变化和污染物-菌属的相关性；（iv）使用基于大肠杆菌的生物测定来筛选急性毒性。

实验试剂和水质特性

头孢噻肟（CEX，纯度≥98%）购自上海麦克莱恩生化有限公司。用超纯水配制了浓度为1000毫克/升的CEX储备溶液，并储存在4°C的棕色玻璃瓶中。每次换水后向反应器中加入适当体积的储备溶液，以分别获得R1、R2、R3和R4反应器中目标浓度为5、10、15和20毫克/升的CEX。

实验使用了实际收集的生活污水

CEX对氨氧化细菌的影响

每个SBR循环开始和结束时测定的NH₄⁺-N用于评估AOB活性。在持续暴露于CEX的情况下，所有反应器都经历了初始的氨去除下降和随后的部分恢复。在第一阶段（R1：第0-53天；R2：第0-25天；R3和R4：第0-30天），氨去除率（ARR）下降，NH₄⁺-N积累，表明AOB受到强烈抑制。在第二阶段（R1：第54-117天；R2：第26-117天；R3和R4：第31-117天），NH₄⁺-N逐渐减少，ARR恢复，表明

结论

本研究通过整合性能、EPS分离、相分布、LC–MS/MS指纹、群落变化和毒性筛选，阐明了在长期高浓度暴露下硝化污泥中头孢噻肟（CEX）的EPS重组命运。EPS重组与CEX的分配和明显的CEX消耗密切相关，EPS层特异性的指纹支持了EPS层逐步转化的解释。实际上，

作者贡献声明

陈永志：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，资金获取，概念构思。王晓霞：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法学，概念构思。刘洪：撰写——初稿，监督，方法学，概念构思。唐志强：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，软件，方法学，调查，正式分析。罗杰：软件，方法学

未引用参考文献

Tang等人，2022年。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了甘肃省科技计划（技术创新指导计划）-东西部科技合作专项项目（24CXNA029）、甘肃省教育厅：大学科学研究创新平台重大培育项目（2024CXPT-14）、甘肃省重点研发计划 - 工业项目（项目编号25YFGA054）、兰州科技项目（2024-8-42）的支持