乳酸乳球菌N8中的一种新型抗氧化系统

《Food Bioscience》：A novel antioxidant system in Lactococcus lactis N8

本研究发现乳酸乳球菌N8中RmaH调控Dps基因的新机制，RmaH在高氧条件下抑制Dps表达，通过DNA结合及抗氧化作用增强氧耐受性，为工业菌株优化提供新靶点。

　　

黄欢|徐茜|刘凤鸣|王栋东|辛永平|乔明强

教育部化学生物学与分子工程重点实验室，山西大学生物技术重点实验室，生物技术研究所，太原，030006，中国

摘要

乳酸乳球菌在适度氧条件下的生长能力使其得以从食品工业扩展到微生物细胞工厂的应用。虽然利用已知的抗氧化调控机制是工程化高氧条件下的强健菌株的一种有前景的策略，但乳酸乳球菌的耐氧性的完整遗传基础仍不完全清楚。在这里，我们鉴定并表征了乳酸乳球菌 N8中的一种新的抗氧化系统及其相应的调控机制。遗传分析表明，MarR家族的转录调节因子RmaH在介导氧化应激反应中起着关键作用。转录组学和qPCR分析进一步揭示RmaH作为dps的转录抑制因子，而< />编码一种来自饥饿细胞的DNA结合蛋白。体外和体内的蛋白质-DNA结合实验确认RmaH特异性结合< />的编码序列（CDS），DNase I足迹分析精确定位了结合基序（TGTAAG-12nt-CTTTCA）。最终，功能研究表明，在氧条件下，RmaH的表达受到抑制，导致< />的表达上调。< />通过两种不同的机制提供细胞保护：物理上屏蔽DNA免受羟基自由基的损伤，并通过其铁氧还蛋白活性抑制芬顿反应。总体而言，我们的发现阐明了一条先前未被描述的RmaH-Dps调控途径，该途径增强了乳酸乳球菌的耐氧性，为工程化工业强健菌株提供了机制上的见解和潜在靶点。

引言

近年来，消费者对含有益生菌的食品兴趣日益增加，推动了全球新型益生菌产品需求的激增。这一趋势突显了推进这类功能性食品开发的重要性。乳酸菌（LAB）作为革兰氏阳性微生物，在食品生产和发酵过程中一直至关重要，对人类日常生活起着重要作用（Leroy & De Vuyst, 2004; Liu et al., 2019; Song et al., 2017）。乳酸乳球菌被美国食品药品监督管理局（FDA）列为公认安全（GRAS）物质，由于其遗传背景明确、独特的发酵能力和优异的生物活性而具有显著的应用潜力（Kalam et al., 2023）。合成生物学和代谢工程的进步将其应用范围从传统食品生产扩展到了微生物细胞工厂（Xin et al., 2025; Xin & Qiao, 2025）。这种微生物不仅通过发酵改善食品风味，还合成益生元、细菌素和其他有价值的代谢产物（Akpoghelie et al., 2025; Qiao et al., 2022; Zeidan et al., 2017）。然而，在工业生产过程中，乳酸乳球菌容易受到各种环境压力的影响，尤其是氧化应激，这可能会影响发酵产品的质量和其益生菌功效（Papadimitriou et al., 2016; Qiao et al., 2020）。

氧化应激是由于活性氧（ROS）如超氧阴离子（O₂^-）、过氧化氢（H₂O₂）和高度反应性的羟基自由基（·OH）的过量产生而引起的。此外，在动物和人体内，LAB可能会遇到免疫系统对外来微生物产生的ROS（Galdeano et al., 2007; Songisepp et al., 2005）。LAB具有内在的抗氧化防御机制，包括特定的酶和氧化还原途径（Ghiasi et al., 2023）。例如，在乳酸乳球菌中，< />突变体在有氧条件下的生长速率显著降低（Sanders et al., 1995），谷胱甘肽（GSH）可以激活谷胱甘肽过氧化物酶/还原酶系统来解毒H₂O₂并保护乳酸乳球菌免受氧化损伤（Li et al., 2003）。然而，尤其是乳酸乳球菌中这些反应的调控网络尚未完全明了。

MarR家族的转录因子以大肠杆菌的多重抗生素抗性调节因子命名，是一类普遍存在的细菌蛋白，能够调控多种生物过程，包括适应氧化应激、毒力、代谢途径和抗生素抗性（Davis & Sello, 2010; Ellison & Miller, 2006; Grove, 2013; Perera & Grove, 2010; Perera et al., 2009; Wilkinson & Grove, 2006）。例如，分枝杆菌中的OhrR通过半胱氨酸残基感知细胞内的有机过氧化物（Garnica et al., 2017），紫色色杆菌中的OsbR控制氧化应激反应（Alves et al., 2021）。尽管MarR家族调节因子在细菌应激反应中的重要性已得到充分证实，但它们在乳酸乳球菌中的具体作用和机制仍大部分未得到探索。在这项研究中，通过对乳酸乳球菌 N8基因组的生物信息学分析，鉴定出一个名为RmaH的MarR家族转录调节因子，其在氧化应激反应中的功能目前尚不清楚。因此，本研究的目的是探讨RmaH在介导氧化应激反应中的作用，并阐明其在乳酸乳球菌 N8中的潜在调控机制。这项工作为增强乳酸乳球菌的抗氧化能力奠定了机制基础，从而支持其在开发益生菌食品中的更广泛应用。

部分摘要

细菌菌株和生长条件

本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表1中。乳酸乳球菌 N8及其衍生物在GM17培养基（Hopebiol，青岛，中国）中于30°C下培养。大肠杆菌菌株在Luria-Bertani（LB）培养基（Thermo Fisher Scientific）中于37°C下培养。固体培养基通过向GM17或LB培养基中添加1.5%（w/v）琼脂粉制备。必要时，按以下浓度添加抗生素：200 μg/mL红霉素、100 μg/mL氨苄西林、50 μg/mL

删除rmaH增强乳酸乳球菌N8的抗氧化能力

为了研究RmaH是否参与N8的氧化应激反应，我们首先基于同源重组构建了一个敲除菌株（N8ΔrmaH）（图1a）。使用表2中列出的引物和基因组DNA作为模板，通过PCR扩增验证了N8和N8ΔrmaH的基因型。rmaH基因长度为465 bp，扩增片段与预期大小一致（图1b）。同时，通过引入pLEB124-rmaH生成了rmaH过表达菌株N8::rmaH

讨论

乳酸菌（LAB），特别是乳酸乳球菌，广泛用于食品发酵和益生菌开发，其中氧化应激是限制其存活率和性能的主要因素（Averill-Bates, 2024）。然而，许多氧化应激响应基因的调控因子尚未被充分研究。本研究揭示了一条先前未被描述的RmaH-Dps调控途径，该途径增强了乳酸乳球菌 N8的氧化应激耐受性。这一发现为理解乳酸菌的氧化应激耐受性提供了重要的理论依据

结论

本研究阐明了一条新的RmaH-Dps调控途径，该途径调节乳酸乳球菌的氧化应激耐受性，揭示了RmaH在乳酸菌氧化应激反应中的先前未知作用。氧化应激会解除对该途径的抑制，导致< />的表达上调，进而保护DNA并抑制芬顿反应。这些发现不仅推进了对食品级LAB应激调控机制的基本理解，还为实际应用提供了遗传学依据

CRediT作者贡献声明

王栋东：研究。刘凤鸣：资金获取、正式分析、数据管理。徐茜：资源提供、研究。黄欢：写作——审阅与编辑、初稿撰写。乔明强：写作——审阅与编辑、监督、资金获取。辛永平：写作——审阅与编辑

利益冲突声明

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数据可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充材料中。

利益冲突声明

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致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：31770102）和山西省青年科学基金（编号：202203021222007）的支持。