《Food Bioscience》：Anti-Inflammatory Potential of Teichoic Acids from
Lactiplantibacillus plantarum AR113 and Their Effects on Host Immune Responses
薛莉 | 王光强 | 张明书 | 蔡启晓 | 崔树茂 | 赵亮 | 宋欣 | 夏永军 | 熊志强 | 艾连忠
上海工程技术大学食品微生物学上海工程研究中心健康科学与工程学院，中国上海200093
摘要：
来自不同革兰氏阳性细菌的壁酸（TA）对宿主的炎症反应具有不同的影响。在本研究中，我们通过使用AR113的关键TA合成基因敲除菌株，探讨了Lactiplantibacillus plantarum（L. plantarum）AR113产生的TA对炎症的调节作用。研究结果表明，TA的存在通过减弱TLR2（MyD88/MAPK轴）触发的促炎信号通路，降低了AR113的抗炎活性。在体外实验中，AR113Δltas处理的细胞产生的 nitric oxide (NO) 减少了15.8%，AR113Δdlt减少了48.5%，AR113ΔtagO减少了51.2%（p < 0.05）。此外，无论是在体外还是体内，AR113ΔtagO都能有效减少促炎细胞因子的产生，而AR113Δltas和AR113Δdlt则促进了抗炎细胞因子的产生。值得注意的是，D-Ala支链似乎是AR113产生的TA引发炎症反应的关键因素，因为只有AR113Δdlt对巨噬细胞的细胞毒性作用显著降低（p < 0.01）；并且AR113Δdlt在缓解结肠炎症状方面表现最佳，疾病活动指数（DAI）降低幅度优于AR113干预组（4.45±1.73 vs 5.30±1.85）。然而，进一步的小鼠肠道屏障研究表明，AR113产生的TA对屏障相关基因没有显著影响，表明TA不会损害小鼠的肠道屏障，它们主要针对免疫反应。总体而言，本研究确定了增强益生菌抗炎特性的潜在靶点。
引言
壁酸（TAs）是主要的阴离子聚合物，占革兰氏阳性细菌细胞壁干重的50%（Lebeer, Vanderleyden, 和 De Keersmaecker, 2008）。它们主要以两种形式存在：壁壁酸（WTA），与肽聚糖共价连接；以及脂壁酸（LTA），锚定在细胞质膜中并延伸穿过细胞壁（Covas等人，2016）。功能上，WTA决定了细胞壁的关键表面特性，如电荷、通透性和与宿主细胞的相互作用，而LTA则作为维持膜生理的关键分子模式（Jeong等人，2023）。决定TA生物活性的一个关键修饰是在多醇-磷酸骨架上引入D-丙氨酸（D-Ala）残基（Roethlisberger等人，2000）。
TA诱导炎症是它们的主要免疫功能。在许多致病性革兰氏阳性细菌中，LTA通过引发强烈的促炎反应而成为主要的毒力因子。例如，Streptococcus mutans（S. mutans）（van Dalen, Peschel, 和 van Sorge, 2020）和Staphylococcus aureus（S. aureus）（Ali等人，2020；van Dalen等人，2019）产生的LTA可以引发炎症。与此一致，缺乏LTA的Streptococcus pneumoniae（S. pneumococcal）突变体在小鼠模型中的急性肺炎和全身感染中的毒力减弱（Hess等人，2017）。有趣的是，无论是致病性还是非致病性细菌产生的LTA都能诱导NO的产生，这表明炎症反应加剧（Ryu等人，2009）。换句话说，益生菌微生物的情况更为复杂，并非所有益生菌产生的TA都具有抗炎作用，尽管它们也是革兰氏阳性细菌。从Lactobacillus物种中纯化的LTA可以抑制S. aureus LTA诱导的THP-1细胞炎症（Kim等人，2008），改善HT-29细胞、结肠炎小鼠模型（Pradhan等人，2023）和LPS诱导的RAW 264.7细胞（Lu等人，2022）的炎症。然而，早期文献报道，缺乏LTA的L. acidophilus不仅能够调节树突状细胞（DCs）的炎症，还能有效缓解硫酸葡聚糖（DSS）诱导的小鼠结肠炎（Mohamadzadeh等人，2011）。此外，一种缺乏LTA侧链D-ala的L. plantarum突变株，在Toll样受体3（TLR3）诱导的肺浸润伴嗜酸性粒细胞增多（PIE）细胞中，能够增强免疫因子干扰素-β（IFN-β）的产生（Mizuno等人，2020）。这一发现表明LTA支链上的D-Ala残基对炎症诱导有贡献。此外，使用L. plantarum WCFS1的WTA突变株刺激后，人类树突状细胞分泌的白细胞介素-12（IL-12）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症细胞因子的水平显著降低（Bron等人，2012）。总之，益生菌产生的TA对炎症反应具有不同的、有时甚至相反的作用。
革兰氏阳性细菌产生的TA与免疫细胞上的TLR受体结合，通过MyD88激活细胞内信号通路，进而激活NF-κB和MAPK通路。这些因子启动促炎细胞因子和趋化因子的生成，引发炎症，招募免疫细胞，并参与适应性免疫反应（Kawai和Akira，2010）。TA的结构多样性——例如WTA上的糖替代变化或LTA锚定部分的脂质组成——在不同微生物之间存在差异。这些修饰导致其物理化学和功能特性的不同（Akulava等人，2024；Percy和Gründling，2014）。如前所述，不同益生菌菌株产生的TA在免疫调节特性上具有菌株特异性，这主要归因于不同乳酸菌（LAB）菌株间TA的结构差异（Jang等人，2011）。因此，不能一概而论地评价特定益生菌产生的TA对免疫反应的影响，需要进一步研究。
作为肠道中的天然益生菌，L. plantarum可以调节微生物群并防止肠道病原体的入侵（Luiz等人，2025；Shokryazdan等人，2014）。此外，它还能维持黏膜和全身免疫反应，并促进屏障功能（He等人，2024；Liu, Liu和Fang，2024）。我们的团队从传统中国泡菜中提取了L. plantarum AR113（Lin等人，2020）。根据我们之前的研究，L. plantarum AR13具有抗氧化活性（Lin等人，2020）和益生菌功能，包括改善肠道炎症（Xia等人，2020）和减轻上皮损伤（Qin等人，2022）。此外，我们还报道了AR113胆盐水解酶（bsh）基因对结肠炎小鼠的治疗效果（Feng等人，2023）。然而，迄今为止，尚未有研究探讨AR113细胞表面存在的TA是否对其免疫刺激作用有贡献。在本研究中，我们旨在进一步探讨AR113产生的TA在LPS刺激的RAW264.7细胞和DSS诱导的结肠炎小鼠模型中调节炎症反应的作用。
TA的纯度和产量通常较低，分离方法的不同可能会影响其结构完整性，从而限制了对其益生菌功能的研究（Han等人，2023）。WTA和LTA通过不同的途径合成，参与其生物合成的基因可能会阻断其形成并破坏其功能（Pasquina, Santa Maria和Walker，2013）。在本研究中，我们利用CRISPR-Cas9技术针对关键TA合成基因，研究了L. plantarum AR113的TA代谢产物。具体来说，我们通过生成LTA（Δltas）、WTA（ΔtagOdlt）的敲除突变株，来确定TA在调节细胞免疫和DSS诱导的肠道炎症缓解中的作用。我们的目标是推进靶向益生菌疗法的发展，并为治疗免疫相关疾病提供新的调控靶点和概念框架。
部分摘录
细菌菌株、细胞、动物和培养条件
L. plantarum AR113保存在中国普通微生物菌种保藏中心（保藏编号CGMCC No. 13909）。野生型菌株和敲除菌株在37°C的de Man Rogosa和Sharpe（MRS）培养基中静态培养。使用全自动生长曲线分析仪（Bioscreen C. Oy Growth Curves Ab Ltd., 赫尔辛基，芬兰）评估菌株的生长特性，并在37°C下培养48小时，测量600 nm处的光密度（OD600）
关键基因敲除对L. plantarum AR113生理特性的影响
为了确定TA合成基因敲除对L. plantarum AR113生理特性的影响，我们在MRS肉汤中培养各菌株以评估其生长情况。根据生长曲线（图1C），ΔtagO菌株的生长速度较慢，而Δdlt和Δltas菌株的生长速度相对较快。生长速率从高到低依次为：L. plantarum AR113、AR113Δdlt、AR113Δltas和AR113ΔtagO。
从L. plantarum AR113和AR113Δltas中提取了LTA
讨论
当摄入较高剂量时，益生菌对宿主有多种健康益处（Aziz等人，2024）。许多益生菌乳酸菌具有抗炎特性（Cristofori等人，2021；Ladda等人，2023），可以缓解结肠炎小鼠的症状（Wu等人，2022；Naseeb等人，2025；Ahmad等人，2024）。此外，膳食补充益生菌可以增强肠道屏障并减少肠道炎症（Aziz等人，2024）。然而，近年来相关研究显示
结论
本研究阐明了AR113产生的TA对炎症反应的负面影响。减少TA的产生可以增强AR113在体外和体内的免疫调节作用。在TA中，LTA和D-Ala对促炎细胞因子IL-10的产生具有不同的影响，而WTA则没有这种作用。在结肠炎症状的背景下，AR113产生的LTA对炎症反应的贡献大于WTA，尤其是通过LTA中的D-Ala支链
CRediT作者贡献声明
蔡启晓：资源提供、项目管理。张明书：撰写——审阅与编辑、软件使用、数据分析。王光强：方法学研究、资金获取、数据分析。薛莉：撰写——初稿撰写、数据分析。宋欣：数据可视化、验证、资源协调。赵亮：数据可视化、实验设计。崔树茂：数据验证、概念框架构建。艾连忠：项目监督、项目管理、资金获取。熊志强：撰写——
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号32472304）、国家杰出青年科学基金（编号32025029）、上海教育发展基金会和上海市教委的“曙光计划”、无锡工业创新研究院试点技术研发项目（编号XD23001）、上海教委科学研究创新项目（编号2101070007800120）的支持
