《Food Bioscience》：Enhanced Recovery of Fluorescent Pigment–Protein Complexes from
Spirulina Biomass via Ultrasound-Assisted Deep Eutectic Solvent Extraction: Toward Sustainable Natural Food Colorants with Anti-Colorectal Cancer Potential
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高效可持续的蓝藻蛋白提取策略：基于超声波辅助深共熔溶剂的Spirulina platensis中视紫红质的高产与纯化研究，通过响应面法优化得出甘油浓度2.35 M、生物质与溶剂质量比1:17.6、提取时间66分钟、温度40℃的最佳参数组合，制备出纯度达0.81-0.93的食品级视紫红质，其抗氧化能力（DPPH=1.90 mg GAE/g；ABTS=11.30 mg TE/g；PFRAP=3.12 mg GAE/g）和HT-29细胞抗癌活性（IC50=61.42 μg/mL）显著，验证了该绿色工艺在医药与化妆品领域的应用潜力。
瓦吉波恩·马尼乔特（Wageeporn Maneechote）、瓦苏·帕托姆-阿瑞（Wasu Pathom-aree）、纳卡林·苏瓦纳拉奇（Nakarin Suwannarach）、帕查林·柴贾姆（Patcharin Chaijaem）、本贾马斯·切尔西尔普（Benjamas Cheirsilp）、苏帕基特·柴普特（Supakit Chaipoot）、皮鲁恩蓬·斯里蒙科尔（Piroonporn Srimongkol）、胡绍豪（Shuhao Huo）、西拉西特·斯里努安潘（Sirasit Srinuanpan）
泰国清迈大学微生物生物炼制与生化过程工程研究组，清迈50200
摘要
藻蓝蛋白（Phycocyanin，简称PC）是一种从螺旋藻（Spirulina）中提取的蓝色荧光色素-蛋白质复合物，具有强大的抗氧化和抗癌活性，但由于产量低且稳定性差，大规模生产受到限制。本研究开发了一种可持续的高效提取工艺，该工艺采用了天然深共晶溶剂（NADES；甘油-葡萄糖）并结合了超声波辅助提取（UAE）和冻融预处理技术。通过响应面方法（Response Surface Methodology，RSM）优化了提取条件：甘油浓度为2.35 M、生物质与溶剂的比例为1:17.6 g/mL、提取时间为66分钟、温度为40°C。优化后的条件下，可获得高质量的食品级藻蓝蛋白（7.56 g/100 g生物质），其纯度（A620/A280 = 0.81–0.93）接近化妆品级的最低标准。动力学模型显示，在pH 6.0和低温条件下藻蓝蛋白会发生一级降解，表明其在温和条件下具有较好的稳定性。SDS-PAGE分析证实了α-和β-亚基的存在，其分子量约为15–20 kDa，符合藻蓝蛋白的特征。提取的藻蓝蛋白具有较高的抗氧化能力（DPPH = 1.90 mg GAE/g；ABTS = 11.30 mg TE/g；PFRAP = 3.12 mg GAE/g），并对HT-29癌细胞表现出显著的抗癌活性（IC50 = 61.42 μg/mL），能够诱导细胞G1期停滞和凋亡。这种环保的UAE-NADES策略显著提高了藻蓝蛋白的回收率、纯度和生物活性，同时符合绿色化学的原则。这些发现为生产高质量、食品级的藻蓝蛋白提供了可扩展的平台，适用于营养保健品、制药和化妆品行业。
引言
微生物生物质的可持续利用是向循环生物经济转型中的关键支柱，其核心目标是减少浪费并最大化可再生资源的回收。在这一框架下，微藻和蓝细菌作为快速可再生且土地利用效率高的生物质来源具有独特优势（Maneechote等人，2025a）。其中，螺旋藻（Spirulina，学名Limnospira platensis）是最有前景的原料之一。螺旋藻以其极高的蛋白质含量、快速的生长速度、能在非耕地生长的能力以及卓越的光合作用效率而备受关注，非常适合工业应用（Maneechote等人，2025b）。除了作为完整的食品和功能性成分外，其真正的商业潜力在于特定生物分子的定向开发，尤其是藻蓝蛋白（PC）——这种蓝色荧光藻胆蛋白具有很高的商业和生物医学价值（Maneechote等人，2025b；Maneechote等人，2025c）。
藻蓝蛋白是螺旋藻中光捕获复合体的核心成分，在功能和经济上具有重要意义。其强烈的天然蓝色和荧光特性使其可作为天然食品着色剂（E18）、先进的生物医学诊断中的敏感光学探针以及高端化妆品添加剂（Fernandes等人，2023）。市场根据藻蓝蛋白的纯度进行分类：食品级（A620/A280 ≥ 0.7）、化妆品级（≥1.5）和分析级（≥4.0）（Maneechote等人，2025b；Maneechote等人，2025c）。实现高纯度对于进入高端市场以及开发先进应用至关重要。除了工业用途外，藻蓝蛋白还因其强大的抗氧化、抗炎、神经保护和抗癌活性而受到生物医学领域的广泛关注（Aoki等人，2021；Bougatef等人，2025；Pan等人，2022）。作为自由基清除剂和单线态氧淬灭剂，藻蓝蛋白能够调节与细胞增殖、凋亡和慢性炎症相关的关键信号通路。这种多功能性使其成为制药和营养保健品应用的理想候选物质（Bougatef等人，2025），因此迫切需要高效、稳定且可扩展的提取方法。
传统的提取技术（如反复冻融、缓冲液浸渍和高剪切均质化）存在显著缺点：这些方法能耗高、依赖溶剂，并且由于长时间处理、热降解或杂质污染，常常会降低色素的质量（Wils等人，2021；Hilali等人，2022）。螺旋藻坚韧的细胞壁需要苛刻或重复的处理，从而降低产量、纯度和稳定性。为克服这些挑战并符合绿色化学原则，最近的研究转向使用环境友好的溶剂和先进的提取技术。
天然深共晶溶剂（NADES）是一类具有出色生物分子提取潜力的新型绿色溶剂。NADES由氢键供体（HBD）和受体（HBA）组成，具有低毒性、可生物降解性、不可燃性，最重要的是物理化学性质可调（Zin等人，2025a）。通过调整HBD:HBA的比例（例如氯化胆碱、甘油、葡萄糖、尿素或有机酸），可以定制NADES的极性和氢键相互作用，从而选择性地溶解亲水性生物分子（如藻蓝蛋白），比传统水溶剂具有更高的选择性（Zin等人，2025b）。结合超声波辅助提取（UAE）后，NADES能够显著增强提取效果。UAE过程中的声空化会产生微气泡，这些气泡在固液界面附近破裂，有效破坏螺旋藻的细胞壁（Zin等人，2025c），从而提高色素释放、传质效率和提取效率，同时减少能耗和溶剂使用量。
尽管具有这些优势，但针对藻蓝蛋白产量和纯度的UAE-NADES工艺的系统优化仍有限。很少有研究严格应用统计方法来分析溶剂组成、生物质负荷、超声波参数和提取条件之间的相互作用（Sigamani等人，2025）。此外，对色素稳定性、结构完整性和生物活性的全面评估也很缺乏，而这些对于制药和营养保健品应用至关重要。鉴于全球结直肠癌（CRC）发病率的上升（Pan等人，2022），验证可持续提取藻蓝蛋白的抗癌潜力尤为重要。
本研究的目的是利用超声波辅助的NADES系统，开发一种高效、可持续且可扩展的策略，从螺旋藻生物质中提取高纯度的藻蓝蛋白。具体目标包括：（i）筛选多种NADES配方以确定最佳的提取溶剂；（ii）应用响应面方法（RSM）和中心复合设计（CCD）优化提取参数（甘油浓度、生物质与溶剂比例、时间和温度）；（iii）在不同pH和温度条件下分析提取藻蓝蛋白的纯度、分子谱（SDS-PAGE）和物理化学稳定性；（iv）评估其抗氧化活性（DPPH、ABTS和FRAP测试）以及对人类结直肠癌细胞（HT-29）的抗癌潜力。我们假设UAE-NADES方法将获得高纯度、结构稳定的藻蓝蛋白，具有强大的抗氧化和治疗活性。研究结果证实了这种强化提取工艺的有效性，证明了提取物的优质性和稳定性，并验证了其在高价值制药和营养保健品领域的应用潜力。
部分内容摘录
螺旋藻生物质
本研究使用的螺旋藻（Spirulina）platensis的干燥生物质粉末（以前被归类为蓝绿藻），购自泰国清迈Mae Wang地区的Boonsom Farm公司（批号C261067WW-000023）。
深共晶溶剂的制备
天然深共晶溶剂（NADES）采用加热和搅拌法制备（Pavli?等人，2022）。简而言之，NADES混合物是通过结合氢键供体（HBDs）和氢键受体（HBA）制备的
UAE-NADES溶剂和冻融循环的筛选
为了确定从螺旋藻（Spirulina platensis）生物质中提取藻蓝蛋白（PC）的有效溶剂系统，制备了七种天然深共晶溶剂（NADES），比例为1:1摩尔比：氯化胆碱：甘油（ChCl:Gly）、氯化胆碱：葡萄糖（ChCl:Glu）、氯化胆碱：尿素（ChCl:U）、甘油：葡萄糖（Gly:Glu）、甘油：尿素（Gly:U）、氯化胆碱：乳酸（ChCl:L）和氯化胆碱：柠檬酸（ChCl:C）。实验中使用磷酸钠缓冲液（pH 7.0）和去离子水（DI）作为
结论
本研究成功开发了一种高效且环保的工艺，利用天然深共晶溶剂（NADES，由甘油和葡萄糖组成）结合超声波辅助提取（UAE）和冻融循环，从螺旋藻生物质中提取高质量藻蓝蛋白（PC）。通过响应面方法（RSM）优化后，确定了适宜的甘油浓度、生物质与溶剂比例和温和的温度组合
CRediT作者贡献声明
帕查林·柴贾姆（Patcharin Chaijaem）：撰写 – 审稿与编辑。本贾马斯·切尔西尔普（Benjamas Cheirsilp）：撰写 – 审稿与编辑、资金筹集。纳卡林·苏瓦纳拉奇（Nakarin Suwannarach）：撰写 – 审稿与编辑、资源准备。瓦吉波恩·马尼乔特（Wageeporn Maneechote）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化处理、验证、软件使用、项目管理、方法设计、实验设计、数据分析、数据整理。瓦苏·帕托姆-阿瑞（Wasu Pathom-aree）：撰写 – 审稿与编辑、资金筹集。苏帕基特·柴普特（Supakit Chaipoot）：撰写 – 审稿与编辑、资源准备。
数据获取
数据可应要求提供。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
资助
本研究部分由清迈大学（Chiang Mai University）的CMU中期职业研究奖学金计划、朱拉隆功大学（Chulalongkorn University）的Ratchadaphisek Sompoch基金以及泰国国家研究委员会（NRCT）的合同编号N42A680491资助。
致谢
本研究得到了清迈大学（Chiang Mai University）的支持。瓦吉波恩·马尼乔特（Wageeporn Maneechote）获得了清迈大学Proactive Researcher计划的支持（合同编号586/2567，职位编号EX010171）。皮鲁恩蓬·斯里蒙科尔（Piroonporn Srimongkol）和西拉西特·斯里努安潘（Sirasit Srinuanpan）部分得到了朱拉隆功大学（Chulalongkorn University）的支持。
