《Gene Reports》：The characterization and effect of Nanog on OSKM factors in large yellow croaker (
Larimichthys crocea)
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本研究克隆了大型黄颡鱼Nanog基因全长cDNA，发现其包含保守的homeodomain结构。表达分析表明该基因在胚胎早期高表达，gastrulation后显著下降，成体主要在卵巢表达。细胞实验证实Nanog过表达促进增殖及OSKM网络激活，而OSKM成员过表达亦上调Nanog，揭示二者互作调控环路，为鱼类iPSC诱导研究奠定基础。
宁曦|盛凯石|赵伟中|丁远罗|易珍璐|冉莉|廖杰宇|蒋永华
中国厦门集美大学渔业学院海洋养殖育种国家重点实验室，361021
摘要
多能因子Nanog在体细胞重编程和干细胞维持中起着核心作用。在这项研究中，我们鉴定并表征了经济价值较高的海洋鱼类大黄鱼（Larimichthys crocea）中的Nanog基因。我们克隆了大黄鱼的全长Nanog cDNA，序列分析显示其具有保守的同源结构域。表达谱分析表明，Nanog转录本在早期胚胎发生期间大量存在，但在原肠胚形成后急剧下降，表明其具有母源表达模式。在成体组织中，Nanog主要在生殖腺中表达，卵巢中的表达水平显著高于睾丸。通过对大黄鱼肌肉细胞系（LYCMs）的功能检测发现，RNAi介导的Nanog敲低会抑制细胞生长和形态变化，而其过表达则会促进细胞增殖并使细胞形态变得更加密集和圆润。此外，Nanog的过表达还能增强其自身的表达以及内源性OSKM（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）网络的活性。相反，单独过表达每个OSKM因子也会在不同程度上上调Nanog的表达，这表明它们之间存在相互调控的关系。基于这些发现，我们提出了一个初步的调控网络，描述了Nanog与OSKM因子在调节细胞增殖中的作用。本研究首次提供了关于大黄鱼中Nanog的功能性见解，并为未来鱼类多能性调控和诱导多能干细胞（iPSC）的研究奠定了基础。
引言
Nanog基因以及Oct4、Sox2、Klf4和cMyc（OSKM）在诱导体细胞重编程为iPSC（诱导多能干细胞）中起着重要作用，这些基因也是识别干细胞标志物的关键。Nanog最初是在构建小鼠胚胎干细胞（ESCs）cDNA文库时发现的（Wang等人，2003年），它特异性地表达在多能组织中，如囊胚阶段的未分化细胞中（Chambers等人，2003年；Wang等人，2003年）。同时，Nanog对于维持ESCs的多能性至关重要，可以使干细胞长期具有自我更新能力，而不依赖于LIF/STAT3通路（Mitsui等人，2003年）。此外，在将成纤维细胞重编程为iPSC的过程中，Nanog的表达对于建立完全的多能性以及多能细胞和生殖细胞的形成和稳定性是必要的（Chambers等人，2007年；Okita等人，2007年；Silva等人，2009年）。因此，Nanog的表达既是多能性的决定因素，也是多能性的标志。在鱼类中，Nanog最早是在模式生物青鳉（Oryzias latipes）中发现的，其mRNA和蛋白质在青鳉的胚胎发育和成体生殖腺中均有内源性表达，表明Ol-Nanog在胚胎发育过程中起着重要作用（Camp等人，2009年）。随后，Nanog也在其他硬骨鱼类中得到分离，如斑马鱼（Danio renio）（Schuff等人，2012年）、Paralichthys olivaceus（Gao等人，2013年）和Megalobrama amblycephala（Yu等人，2017年）。Nanog在硬骨鱼类生殖腺发育和干细胞中的作用值得进一步研究。
Oct4、Sox2、Klf4和cMyc是调控多能性和细胞重编程的核心转录因子。Oct4在维持多能性和指导胚胎谱系分化中起着关键作用（Olariu等人，2016年），是体细胞重编程为iPSC的核心调控因子（Takahashi和Yamanaka，2006年）。Sox2是胚胎发育的关键调控因子，参与多种组织的器官发生（Jiang等人，2018b）。Sox2与Oct3/4蛋白形成复合物，有助于增强Fgf4基因的表达并共同维持ESCs的自我更新（Maruyama等人，2005年）。Klf4（Kruppel样因子4）是一种具有锌指结构的转录因子，有助于维持稳态（Choi和Roh，2020年）。它在生成多能干细胞以及参与多种生理过程和疾病中发挥作用（Ghaleb和Yang，2017年）。Oct4、Sox2、cMyc和Klf4的异位表达可以使分化细胞恢复到多能状态并进一步生成iPSC（Yu等人，2007年；Eminli等人，2008年）。在鱼类模型中的研究表明，这些因子在早期胚胎发育和细胞分化中具有保守的作用。然而，它们在鱼类中的详细调控机制仍有待阐明。
大黄鱼被称为中国的“国鱼”，是一种独特的离岸经济鱼类，具有中国最高的水产养殖产量。它也是中国八大出口水产养殖产品之一（Jiang等人，2018b）。大黄鱼分布于东海温暖的南部水域，从南海到东海中部，主要分布在福建、浙江和广东（Xu等人，2022年）。随着养殖规模和产量的增加，出现了一些问题，如存活率低、生长缓慢、抗压能力差、性早熟和繁殖率下降，这些问题严重限制了大黄鱼养殖业的健康和可持续发展（Jiang等人，2018a）。通过揭示大黄鱼生长和发育、性别分化和生殖腺发育的分子机制，可以为基因调控的应用提供有效途径。在哺乳动物中，研究人员已经深入研究了Nanog及Oct4、Sox2、cMyc和Klf4等主要多能因子的分子调控机制（Ezeh等人，2005年；Fischer等人，2010年；Villodre等人，2019年）。然而，关于大黄鱼中OSKM与Nanog之间的相互作用和调控机制的研究尚未报道。因此，本研究的目的是利用分子和细胞生物学方法探讨大黄鱼中几种主要多能因子OSKM和Nanog的功能，为理解大黄鱼中多能因子的作用机制提供新的战略模型，并为未来关于大黄鱼细胞分化和iPSC诱导的研究奠定基础。
样本收集和伦理批准
本实验中使用的大黄鱼及其不同发育阶段的胚胎来自中国福建宁德富发渔业有限公司，具有良好的活力。其组织（卵巢、睾丸、大脑、肌肉、肝脏、心脏、肾脏、脾脏和肠道）经过RNA处理后，置于-20°C保存，并在4°C下过夜后再转移到-20°C进行RNA提取。
Nanog的克隆和序列分析
使用Trizol试剂盒（Vazyme，上海）从组织和胚胎中提取总RNA。
大黄鱼Nanog的克隆和特征分析
大黄鱼Nanog cDNA的全长为2643 bp（NCBI基因库ID：OM946587.1），包括417 bp的5′-UTR、720 bp的3′-UTR和1272 bp的ORF，编码一个423个氨基酸的蛋白质（Nanog）（图1A）。Nanog蛋白的估计分子量为46.16 kDa，理论等电点（pI）为6.77，平均疏水性为-0.841。此外，Nanog蛋白包含一个保守的DNA结合结构域：同源结构域（aa：209-271），以及一个可能的polyadenylation位点
讨论
像Nanog这样的多能因子和OSKM网络对于维持干细胞身份和体细胞重编程至关重要。虽然它们在哺乳动物（Chambers等人，2003年；Mitsui等人，2003年；Darr等人，2006年）和一些模式硬骨鱼类（Camp等人，2009年；Theunissen等人，2011年；Wang等人，2011年）中的作用已有充分文献记载，但在具有商业价值的海洋鱼类（如大黄鱼）中的功能数据仍然很少。本研究首次提供了大黄鱼中Nanog的功能性证据
结论
总之，本研究首次对大黄鱼中的Nanog同源物进行了功能表征。我们的主要新发现包括：（1）Nanog在大型海洋硬骨鱼类中表现出母源性和生殖腺特异性表达模式。（2）通过功能检测，我们确定Nanog是细胞增殖的正向调节因子，并揭示了其与OSKM多能因子的相互转录激活关系——这种关系在该物种中尚未被描述。（3）通过
CRediT作者贡献声明
宁曦：撰写——原始草案，研究，概念构思。盛凯石：撰写——原始草案，研究，正式分析。赵伟中：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草案，研究，正式分析，概念构思。丁远罗：研究，正式分析。易珍璐：研究，正式分析。冉莉：正式分析。廖杰宇：正式分析。蒋永华：撰写——审阅与编辑，资金获取，数据管理，
参与同意
所有作者均已讨论研究程序，并对相关问题表示满意，均同意参与本研究。
伦理批准
本研究涉及的所有实验方案均获得了中国科学技术局实验动物管理规定的批准。样本收集和实验方案得到了集美大学渔业学院动物护理和使用委员会的批准（动物伦理批准号：2021–4）。所有动物处理和方法均按照相关指南进行。
代码可用性
不适用。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本项目得到了国家重点研发计划（资助编号：）、国家自然科学基金（资助编号：）、福建省自然科学基金（资助编号：）、厦门市自然科学基金（资助编号：）、南繁水产联合开放基金项目、海南热带海洋大学（资助编号：）以及福建省大学生创新培训计划的支持
