新维氏矛头蝮复合种毒液组学揭示P-III型蛇毒金属蛋白酶/K49磷脂酶A2dichotomy及巴西五价抗蛇毒血清的显著跨种中和活性

《Journal of Proteome Research》：Venomics across the Bothrops neuwiedi Species Complex Revealed a P-III Snake Venom Metalloproteases/K49-PLA2 Dichotomy and a Remarkable Paraspecific Neutralization of the Brazilian Pentabothropic Antivenom

本综述系统揭示了新维氏矛头蝮（Bothrops neuwiedi）复合种毒液的组成与功能多样性，发现其存在P-III型蛇毒金属蛋白酶（SVMP）与K49磷脂酶A2（PLA2）的组成二分现象。研究重点在于证实了巴西Instituto Butantan生产的五价抗蛇毒血清（SAB）对该复合种七种蛇毒均具有显著的免疫反应性和致死性中和能力，为抗蛇毒血清的临床跨种应用提供了重要的分子免疫学依据。

　　

引言

蛇咬伤（Snakebite envenoming, SBE）是世界卫生组织（WHO）认定的被忽视热带病之一，主要影响热带和亚热带地区经济落后农村社区的农业工作者。及时静脉注射安全有效的抗蛇毒血清是唯一科学验证的治疗方法。矛头蝮属（Bothrops）包含48个物种，广泛分布于南美洲。在巴西，该属蛇类咬伤事故占所有蛇咬伤病例的86.4%，是重要的公共卫生问题。新维氏矛头蝮（Bothrops neuwiedi）物种复合体是一个单系群，包含多个在医学上重要的物种，分布范围从巴西东北部延伸至阿根廷南部。尽管其医学重要性，对该复合体物种毒液的毒素组成和功能谱系研究仍不全面。

新维氏矛头蝮毒液蛋白组的深度解析

本研究首次采用自下而上的毒液组学（venomics）工作流程，系统分析了新维氏矛头蝮复合体中七种蛇的毒液：马托格罗索矛头蝮（B. mattogrossensis）、保洛矛头蝮（B. pauloensis）、短毛矛头蝮（B. pubescens）、阿根廷矛头蝮（B. diporus）、新维氏矛头蝮（B. neuwiedi）、大理石矛头蝮（B. marmoratus）和红尾矛头蝮（B. erythromelas）。通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）和SDS-PAGE分析，揭示了毒液在个体和种群水平上显著的种内和种间变异性。

以马托格罗索矛头蝮毒液为例，其毒液蛋白组主要由Zn²⁺依赖的蛇毒金属蛋白酶（SVMP）构成，包括PIII类（28.8%）和PI类（19.8%）。此外，内源性三肽抑制剂（SVMPi, ZBW, 12.8%）、具有催化活性的D49磷脂酶A₂（D49-PLA₂, 6.4%）、肌毒性K49磷脂酶A₂同源物（K49-PLA₂, 7.5%）、L-氨基酸氧化酶（LAAO, 6.9%）、缓激肽增强肽（BPP, 5.8%）、蛇毒丝氨酸蛋白酶（SVSP, 5.7%）、解整合素（DISI, 3.2%）和C型凝集素样蛋白（CTL, 2.5%）也是其重要组成部分。这种毒素库共同导致了矛头蝮咬伤常见的出血、凝血障碍、肌坏死、皮肤坏死和肾毒性等效应。

毒液组成的二分现象与系统发育关联

比较七种蛇的毒液组成，发现了一个有趣的二分现象：毒液组成模式与K49-PLA₂/PIII-SVMP的比率密切相关。具体表现为：阿根廷矛头蝮、新维氏矛头蝮、短毛矛头蝮和保洛矛头蝮的毒液富含K49-PLA₂而PIII-SVMP含量较低；红尾矛头蝮毒液则富含D49-PLA₂，完全缺乏K49-PLA₂，且PIII-SVMP和PI-SVMP含量相近；马托格罗索矛头蝮和大理石矛头蝮毒液中K49-PLA₂和D49-PLA₂比例相近。统计分析显示，高丰度的K49-PLA₂与低丰度的PIII-SVMP之间存在显著的线性负相关。这种组成二分现象与该复合体的系统发育关系相吻合，提示其可能具有进化上的意义。

毒液功能活性的比较分析

功能分析表明，所有研究蛇毒均能诱发水肿、出血、炎症浸润和肌纤维坏死等典型的局部组织损伤。

• •
  胶原酶活性与最小出血剂量（MHD）：毒液的胶原酶活性与RP-HPLC图谱中83分钟洗脱的PIII-SVMP峰的存在呈正相关。具有高胶原酶活性的毒液（如马托格罗索矛头蝮、新维氏矛头蝮、大理石矛头蝮和红尾矛头蝮）其最小出血剂量（MHD）较低，表明其出血活性更强。统计分析证实了胶原酶活性与MHD之间存在显著的负相关。
• •
  磷脂酶A₂活性与肌毒性：红尾矛头蝮毒液因其高含量的D49-PLA₂而显示出最高的磷脂酶水解活性，但其肌毒性却与生理盐水对照组无显著差异。相反，富含K49-PLA₂的短毛矛头蝮毒液表现出最强的肌毒性。研究表明，D49-PLA₂和K49-PLA₂在某些毒液（如马托格罗索矛头蝮和阿根廷矛头蝮）中可能存在协同作用，D49-PLA₂的水解作用破坏细胞膜，从而增强了K49-PLA₂的肌毒性。
• •
  水肿活性：保洛矛头蝮毒液的水肿活性最强，而红尾矛头蝮最弱。水肿高峰出现的时间在不同物种间存在差异，大多数在注射后2小时达到峰值，而新维氏矛头蝮在4小时，红尾矛头蝮在1小时即达到峰值。
• •
  类凝血酶活性：除红尾矛头蝮外，其他物种毒液均表现出显著的类凝血酶活性。红尾矛头蝮毒液的低类凝血酶活性与其SVSP含量较低（7%）以及可能的基因缺失或高纤维蛋白原溶解活性有关。
• •
  致死活性：腹腔注射小鼠的半数致死量（LD₅₀）显示，阿根廷矛头蝮毒液毒性最强（2.01 mg/kg），而红尾矛头蝮毒性最弱（4.87 mg/kg）。有趣的是，毒液的致死性与出血活性（MHD）呈负相关，这与响尾蛇毒液中观察到的功能二分现象（高蛋白酶活性/低毒性与低蛋白酶活性/高毒性）有相似之处。

巴西五价抗蛇毒血清的免疫识别与中和能力评估

巴西Instituto Butantan生产的五价抗蛇毒血清（Soro Antibotrópico, SAB）是由四种矛头蝮蛇毒（雅拉拉卡矛头蝮B. jararaca, 50%；交替矛头蝮B. alternatus, 12.5%；雅拉拉库苏矛头蝮B. jararacussu, 12.5%；穆氏矛头蝮B. moojeni, 12.5%）和新维氏矛头蝮复合体蛇毒（12.5%）免疫马匹后制备的F(ab')₂片段。

本研究应用第三代抗蛇毒血清组学（antivenomics）技术，在毒素分辨率水平上评估了SAB对马托格罗索矛头蝮、新维氏矛头蝮、短毛矛头蝮和大理石矛头蝮四种蛇毒的免疫反应性。结果表明，SAB对所有主要毒素家族（K49-PLA₂, D49-PLA₂, SVSP, PIII-SVMP, PI-SVMP）均表现出广泛的交叉反应性。其对不同蛇毒的最大结合能力存在差异，对新维氏矛头蝮毒液的结合能力最高（165.7 mg毒液/g抗血清），与参考毒液雅拉拉卡矛头蝮（173.1 mg/g）相当。

更重要的是，小鼠体内中和试验证实，SAB能够有效中和所有七种新维氏矛头蝮复合体蛇毒的致死活性。根据历史毒液产量数据估算，治疗该复合体蛇类咬伤平均需要1-2瓶SAB抗蛇毒血清。中和效力（P）与最大结合能力（MaxBind）的比率均大于100%，表明抗血清中能中和关键毒素的抗体比例很高，即使未能完全结合所有毒素，也能通过中和关键毒性成分来消除整个毒液的致死潜力。

结论与展望

本研究首次在新维氏矛头蝮复合体分类修订后，对其七种蛇毒进行了系统的比较表征。揭示了在高度保守的矛头蝮属毒液模式下的种内和种间变异性，并发现了一个与系统发育相关的[高K49-PLA₂/低PIII-SVMP]毒液组成二分现象。

研究的核心发现在于，巴西生产的五价抗蛇毒血清（SAB）对新维氏矛头蝮复合体所有物种的毒液均表现出显著的免疫交叉反应性和致死性中和能力。抗蛇毒血清组学数据从分子水平揭示了其广泛 paraspecificity 的免疫学基础：即在矛头蝮属长达1200-1600万年的自然历史中，主要毒素家族上的免疫反应性表位得到了高度保守。这一发现不仅为SAB抗蛇毒血清的临床跨种应用提供了坚实的科学依据，也为未来提高抗蛇毒血清效价和扩大其临床应用范围提供了线索。