《Frontiers in Immunology》：Mafb deficiency in myeloid cells increases susceptibility to Mycobacterium tuberculosis infection in mice
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本研究发现髓系特异性Mafb基因敲除（Mafb-cKO）小鼠在结核分枝杆菌（Mtb）感染中表现出更高的死亡率和细菌负荷。研究通过RNA测序（RNA-seq）揭示Mafb缺失导致巨噬细胞代谢过程异常、I型干扰素（IFN）反应受损，并削弱肺部白细胞趋化作用。流式细胞术证实感染肺部免疫细胞比例改变。结果表明Mafb不仅调控巨噬细胞抗菌功能，还影响免疫细胞在肺部的招募，为宿主防御Mtb感染提供了新机制见解。
引言
结核病（Tuberculosis, TB）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起，已成为全球首要传染病，2023年新增820万病例并导致120万人死亡。全球约四分之一人口潜伏感染Mtb，其一生中发展为活动性结核的风险为5-10%，在免疫抑制状态下风险显著增加。因此，潜伏感染管理对阻断传播和实现全球结核消除至关重要。全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study, GWAS）发现，v-Maf禽肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B（MAFB）与早发型结核病相关，位于染色体20q12的一个显著位点附近，提示MAFB在宿主控制Mtb感染 immunity 中发挥作用。MAFB属于大Maf转录因子家族，具有保守的碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZip）结构，可特异性结合Maf识别元件（Maf-recognition elements, MAREs）。Mafb在多种器官发生和巨噬细胞稳态维持中起关键作用，并参与抗病毒反应和巨噬细胞极化调控。前期研究显示，MAFB敲低（knockdown, KD）可调节Mtb感染人巨噬细胞中干扰素（interferon, IFN）相关基因表达。本研究利用髓系特异性Mafb条件性敲除（Mafb-cKO）小鼠，探讨Mafb在Mtb感染结局和机体免疫细胞动态相互作用中的角色。
材料与方法
动物实验经结核病研究所（Research Institute of Tuberculosis, RIT）动物护理与使用委员会批准。使用巨噬细胞特异性Mafb条件性敲除（Mafbf/f::LysM-Cre+/+或Mafbf/f::LysM-Cre+/-, Mafb-cKO）及Mafbf/f对照小鼠。从Mafb-cKO和对照小鼠（6周龄）后腿分离骨髓，经L929条件培养基诱导7天分化为骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMMs）。BMMs以感染复数（multiplicity of infection, MOI）为1感染Mtb Erdman株。感染后1、3、7天通过菌落形成单位（colony-forming unit, CFU）测定细胞内细菌数量；感染后1天通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放测定细胞毒性。实验小鼠（6-10周龄）通过气溶胶途径感染Mtb，感染后监测生存期达315天，并在4、10、20周检测肺和脾脏细菌负荷。对感染24小时的BMMs或感染10周、20周的小鼠全肺叶进行mRNA测序（mRNA sequencing, mRNA-seq），使用Trim Galore、Salmon、edgeR等工具进行数据质控、表达量估计和差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析，并通过Gene Ontology（GO）、KEGG通路和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）挖掘功能。利用流式细胞术分析感染肺组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞比例。通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测肺组织切片S100a9+中性粒细胞浸润。
结果
Mafb缺陷促进巨噬细胞内Mtb增殖
与对照相比，Mafb-cKO BMMs在感染后3天和7天显示更高的细胞内Mtb CFU数量，表明Mafb缺失使巨噬细胞更利于Mtb增殖。感染后3天，Mafb-cKO BMMs的Mtb诱导细胞毒性也更高，与细菌负荷增加一致，提示宿主细胞死亡加速了细胞内Mtb生长。
Mafb-cKO BMMs在Mtb感染中呈现代谢过程和免疫反应的功能改变
感染24小时的Mafb-cKO BMMs mRNA-seq鉴定出1223个DEGs。GO分析显示，上调DEGs富集于白细胞细胞间黏附、活性氧（reactive oxygen species, ROS）代谢过程、核苷酸代谢过程等；下调DEGs富集于病毒反应、对共生体防御反应、先天免疫反应调控等。基因概念网络显示，上调基因涉及整合素（Itgb2、Itgb7、Itgal）、白细胞表面受体（Ccr2、Cx3cr1、Cd74）、MHC分子（H2-Ab1、H2-Aa）等，提示巨噬细胞积极参与免疫监视、细胞通讯和抗原提呈；ROS代谢相关基因包括ROS生成（Cybb、Cyba）、解毒（Prdx1、Nnt）和氧化应激调控（Thbs1、Rhoa）。下调基因多与RNA编辑修饰（Apobec1、Adar）、先天免疫感受器、IFN刺激基因（ISGs）（Ifit1、Ifit2、Ifit3）、转录因子信号转导（Pou2f2、Il10rb）等相关，表明病原体感知和IFN反应减弱。KEGG分析显示上调DEGs富集于氧化磷酸化和化学致癌-ROS通路；下调DEGs富集于ECM-受体相互作用、溶酶体和内吞作用通路。溶酶体通路图中质子泵ATP eV（参与溶酶体酸化）表达下调。qRT-PCR验证了Cd74、H2-Ab1、Mmp12、Nnt上调及Ccl2、Gas6、Ifit3下调。GSEA显示Mtb感染免疫反应通路在Mafb-cKO BMMs中受损，与前期Mtb感染MAFB-KD人巨噬细胞结果一致。
巨噬细胞Mafb缺陷增加小鼠Mtb感染死亡率
Mafb-cKO小鼠感染后20周开始体重下降并出现死亡，至45周时全部死亡；雌性和雄性中位生存期分别为212天和208天，显著短于野生型（wild-type, WT）小鼠。感染10周和20周时，Mafb-cKO小鼠肺和脾脏细菌负荷均显著高于对照，表型与BMMs实验结果一致。
Mtb感染Mafb-cKO小鼠全肺转录组学
感染10周时，Mafb-cKO肺中鉴定出89个DEGs（48个上调、41个下调）。GO显示细胞间黏附、白细胞增殖、T细胞活化调控等激活，而补体活化、II型IFN细胞反应、突触修剪等抑制。基因网络提示Cd1d1、Cdkn2a、Tarm1、Havcr2、Slfn1为T细胞调控关键基因。KEGG分析显示上调DEGs富集于破骨细胞分化（与Mafb负调控RANKL介导的破骨细胞分化一致），下调DEGs富集于补体和凝血级联、趋化因子信号通路（如Ccl8、Ccl12、Pf4）。感染20周时，鉴定出267个DEGs。GO显示髓系白细胞活化、分化、巨噬细胞活化调控、内吞调控、血管生成调控等上调，而白细胞迁移、趋化、增殖、免疫反应细胞表面受体信号通路等下调。基因网络中，上调DEGs包括Csfs（GM-CSF）、Mmp8、Cd177、Sirpb1家族等，突出髓系免疫细胞强分化活化；下调DEGs涉及趋化因子信号或白细胞迁移（Ccl22、Ccl8、Ccl5、Cx3cr1、Pf4、Ccr7）、T细胞活化与免疫耐受调控（P2rx7、Nfatc2、Ptpn22）、B细胞免疫（Cd22、Icosl）等，提示肺中适应性免疫激活和白细胞/淋巴细胞招募减少。qRT-PCR验证了部分基因表达趋势。将DEGs与MafB ChIP-seq数据比较发现，Mafb-cKO BMMs中33.8%的DEGs（413个）为MafB直接靶标；感染10周肺中为31.5%（28个），20周时降至20.6%（55个），表明感染后期转录组变化更多由Mafb缺失的间接效应主导。
Mtb感染Mafb-cKO小鼠肺部免疫细胞招募
流式细胞术显示，对照小鼠肺中CD4+和CD8+T细胞频率在感染10周时较高，20周时下降；而Mafb-cKO小鼠中两者频率在感染期间保持稳定，提示其感染早期T细胞招募受阻。B细胞频率在对照中稳定，在Mafb-cKO小鼠感染20周时下降。尽管趋化因子信号受损，Mafb-cKO小鼠肺中中性粒细胞频率在10周和20周均显著高于对照。间质巨噬细胞频率在Mafb-cKO中略有降低但无统计学意义。IHC显示Mafb-cKO小鼠肺淋巴细胞富集肉芽肿区S100a9+信号更强、中性粒细胞浸润更多。
讨论
本研究通过髓系特异性Mafb-cKO模型阐明Mafb在Mtb感染中的关键作用。转录组学表明Mafb缺失导致巨噬细胞ROS代谢过程激活、I型IFN反应抑制，与前期人巨噬细胞研究一致。Mafb-cKO BMMs中Mtb增殖增加可能与溶酶体生物发生受损（如ATP eV下调）、ROS代谢失调等巨噬细胞内在缺陷相关，而非I型IFN信号减少所致（因后者通常与疾病恶化相关）。II型IFN通路基因在Mafb-cKO BMMs和小鼠感染肺中下调，可能是细菌负荷增加的次级效应。
肺转录组显示Mafb缺失激活髓系免疫细胞分化，与低Mafb水平激活驻留巨噬细胞自我更新报道一致。流式细胞术证实Mafb-cKO小鼠肺中性粒细胞浸润增加，可能与巨噬细胞坏死和细菌复制诱导有关，而过度中性粒细胞招募会加剧结核病理。Mafb-cKO小鼠肺中单核细胞浸润个体间差异大，提示Mafb缺失通过改变细胞因子环境（如IFNs和趋化因子梯度）导致单核/巨噬细胞状态异质性增加。
Mafb缺陷还削弱了感染早期肺部CD4+和CD8+T细胞招募，表明适应性免疫受损。CD4+T细胞及其产生的IFN-γ对巨噬细胞激活和宿主防御Mtb至关重要。
综上，Mafb在髓系细胞中通过调控巨噬细胞抗菌功能（如溶酶体成熟、ROS平衡）和肺部免疫细胞招募，共同促进宿主防御Mtb感染。ChIP-seq比较提示感染早期转录变化多由Mafb直接调控，而后期以间接网络为主，可能与疾病进展相关。
局限性
尽管Mafb-cKO BMMs在感染7天时CFU显著升高，但细胞毒性测定未检测到相应增加，可能与测定灵敏度、培养基更换影响代谢读数有关。荧光标记细菌的显微镜检测未显示组间明显差异，或因动态范围有限、信号饱和及无法区分活菌所致。ELISA未检测到Mafb-cKO BMMs中Ccl2和Cxcl10蛋白水平显著变化，与转录组数据不一致。此外，未评估Mafb-cKO小鼠肺中T细胞活化状态，因此无法完全阐明Mafb缺陷如何影响细胞内细菌复制、巨噬细胞死亡模式与下游免疫应答间的关系。
