《Frontiers in Immunology》：CMTM8 variants influence BNT162b2 COVID-19 vaccination response by regulating granulocytic/polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell activity
背景
新型冠状病毒SARS-CoV-2大流行的出现促使了前所未有的研究工作投入到开发新的疫苗接种策略中，在极短的时间内鉴定出了针对该病毒的有效化合物。多种mRNA疫苗被开发出来，并且该技术已被证明非常安全有效。辉瑞- BioNTech COVID-19 mRNA疫苗在2020年底获得了欧盟、英国和美国的完全批准。它由插入脂质纳米颗粒的合成核苷修饰mRNA分子（BNT162b2）组成。注射后，脂质纳米颗粒将BNT162b2递送到宿主细胞，在那里mRNA通过宿主的翻译机制被翻译成免疫原性抗原。然后该抗原通过主要组织相容性复合体（MHC）I类途径呈递，该途径涉及HLA-A、-B和-C基因，并展示源自细胞内的肽。
BNT162b2疫苗功效的确切免疫学机制仍然知之甚少。在使用这种疫苗和其他疫苗进行广泛的COVID-19免疫接种活动之后，已经进行了遗传关联研究，以调查个体的遗传背景是否可能影响疫苗接种功效。HLA区域与疫苗接种后的抗刺突蛋白免疫球蛋白G（anti-S IgG）滴度以及疾病严重程度和易感性相关。在遗传关联分析中，其他位点达到了提示性的显著性水平（p值 < 10-6），尽管在不同研究的结果中观察到了相当大的变异性。
本文旨在通过对来自SerGenCovid-19倡议的1,968名参与者在接种辉瑞-BioNTech COVID-19疫苗后的anti-S IgG水平进行全基因组关联研究（GWAS），以调查宿主遗传因素对SARS-CoV-2疫苗接种反应的影响。SerGenCovid-19是一项队列研究，包含来自意大利普通人群的7,169名经过基因表征的个体。研究人员分析了超过800万个遗传变异，这些参与者均在2021年5月至2022年2月期间加入研究并接种了两剂疫苗。研究确认了HLA区域一个先前报道的信号，并鉴定了CKLF Like MARVEL跨膜域包含8（CMTM8）基因中的一个变异。CMTM8属于趋化因子样因子基因超家族，充当肿瘤抑制因子、免疫趋化激活剂，并调节细胞增殖、分化和凋亡。有趣的是，最强的表达已在胰腺中得到证实，这是SARS-CoV-2的关键靶标，因为SARS-CoV-2在体外和体内对胰腺外分泌和内分泌细胞的浸润与胰腺损伤有关。CMTM8变异与粒细胞性/多形核髓源抑制细胞（PMN-MDSC）的激活水平相关，PMN-MDSC是一类具有动态特性的髓系来源细胞群，具有抑制适应性免疫反应的能力。总的来说，PMN-MDSC的扩增已被描述为与多种病理状况呈正相关，包括脓毒症和急性炎症反应，最近被认为是COVID-19疾病严重程度的预测因子。越来越多的证据支持MDSC在非病理环境如疫苗接种中的作用，它们可以限制疫苗功效。本研究的结果有助于阐明BNT162b2疫苗功效背后的免疫学机制。
材料与方法
研究队列与数据收集
本研究中使用的样本是SerGenCovid-19项目的一部分，该项目是意大利国家研究委员会的一项倡议，旨在确定参与COVID-19疫苗接种反应和SARS-CoV-2感染易感性的遗传和血清学因素。在采血之前，要求SerGenCovid-19项目的参与者通过安全、访问受限的在线问卷提供健康、既往史和生活方式信息。在大约九个月的时间内收集了血液样本，从而建立了一个代表意大利人群的生物样本库。SerGenCovid-19项目成功收集了来自意大利各地的7,169名参与者的数据。
所有参与者均提供了对研究方案的书面知情同意。
样本收集在2021年5月至2022年2月期间进行。收集的个人和临床信息包括年龄、性别、吸烟状况、疫苗接种日期和类型以及采血日期。获取外周血样本以提取基因组DNA并分离血清。测量了血清中针对SARS-CoV-2刺突蛋白（anti-S）和核衣壳蛋白（anti-N）的抗体滴度。使用LIAISON SARS-CoV-2 TrimericS IgG检测（DiaSorin）评估anti-S IgG水平，并使用Elecsys Anti-SARS-CoV-2检测（Roche）评估总体anti-N抗体。
测量在第二次给药后中位时间87天进行（范围：1–309天；平均值：103天；四分位距：114天）。为了准确评估疫苗反应，排除了1,086份显示先前SARS-CoV-2感染血清学证据（抗核衣壳抗体水平 > 1.1 UM ICO）的样本。剩余的样本集根据所接种疫苗的类型进一步限制，仅保留在40天间隔内接受了两剂BNT162b2（辉瑞-BioNTech）疫苗且通过数据质量控制过滤的参与者（n=2,046）。排除了三级亲属以内的相关个体，最终样本量为1,968人。
全基因组基因分型、插补和数据质量控制
血液样本收集在EDTA管中，并使用QIAcube QIAamp DNA Mini Kit按照自动化方案提取基因组DNA。使用Infinium? Global Screening Array-24 v3.0 BeadChip（Illumina）进行基因分型，该芯片检测整个人类基因组中约65万个标记。
使用GenomeStudio? 2.0数据分析软件进行标准化、聚类和调用基因型，标准调用率≥98%。调用率低于98%的样本被排除在进一步分析之外。
然后使用PLINK v1.9进行基因型数据的质量控制（QC）。仅保留缺失率<2%的样本。此外，仅当个体显示报告的性别与基因推断的性别一致，并且没有过度杂合性（即在平均值+/-3个标准差范围内）时才被纳入。
通过仅包括次要等位基因频率（MAF）高于0.01且哈迪-温伯格平衡检验p值 > 1 × 10?5的变异来过滤标记。
为了生成高密度遗传图谱，使用Minimac通过TOPMed Imputation Server和TOPMed-r2参考面板对质量控制后的基因型进行基因型插补，该参考面板包含来自约93,000名深度测序的不同祖先个体的单倍型。首先，使用Eagle v2.4将基因型数据与参考面板进行相位化。在插补前QC期间因与参考面板不匹配而被排除的SNP随后被适当切换或翻转。插补后，仅包括具有高插补质量的变异（对于MAF ≥ 0.05，r2信息得分 >= 0.3；对于0.01=2信息得分 >= 0.6），总共产生8,080,429个变异（7,557,722个SNP和522,707个indel）适合下游分析。
统计分析
使用Kolmogorov-Smirnov检验检验了anti-S IgG水平分布的正态性零假设，并被拒绝（p值 < 0.05）。因此，使用逆正态变换对该定量变量进行标准化，如Yang及其同事的工作所述。
使用R的lm()函数进行线性回归分析，以评估anti-S IgG水平与基因型之间的关联，并将性别、年龄、体重指数（BMI）、吸烟状况（是或否）以及疫苗接种与采血之间经过的时间作为协变量。这些自变量（以及其他几个解释生物特征参数以及合并症和治疗的变量）被包含在模型中，因为它们显著影响IgG水平（模型调整R2= 0.43）。使用PLINK中的线性回归模型（–linear函数）对anti-S IgG水平进行GWAS。
使用PLINK（–adjust选项）通过lambda统计量评估基因组控制。使用R中的qqman库生成Manhattan和QQ图。使用R中的locuszoomr库创建区域关联图。
在3号和6号染色体上两个最显著的GWAS信号处进行条件关联分析，使用加性线性模型。在每一步中，将先导SNP作为协变量包含在针对性别、年龄、BMI、吸烟状况以及第二次疫苗剂量与采血之间经过时间调整的模型中，使用PLINK的–cond函数。通过将我们的结果与先前发表的关于类似表型的研究和COVID-19相关GWAS中的结果进行比较，评估GWAS发现的可重复性。
进行遗传共定位分析，以检验我们的表型是否与其他研究中调查的免疫性状共享因果遗传变异，使用coloc工具。具体来说，我们在撒丁岛人群免疫谱数据库的汇总统计中搜索了我们全基因组显著先导变异rs2596436和rs7643677的存在，该数据库包括731个定量免疫性状，包含118个细胞计数、192个细胞比例、389个表面抗原中位荧光强度（MFI）的表达水平和32个来自3,757个个体的形态学参数。对于上述两个变异，我们选择了具有最显著关联p值的免疫表型，然后在跨越关联变异+/- 100 kb的基因组区域进行共定位分析。
如果我们的先导SNP不存在于用于重复或共定位分析的数据集中，则使用与先导变异具有最强连锁不平衡（LD，r2≥0.8）的变异代替。
对于任何给定的SNP对，使用PLINK（–ld选项）获得连锁不平衡和同相等位基因（即在同一单倍型上共同遗传的等位基因）。
对GWAS结果进行精细定位，以识别潜在的因果变异和候选基因。
使用Ensembl Variant Effect Predictor对遗传变异进行注释，以评估其潜在功能后果和与已知基因组特征的重叠。使用coloc包的finemap.abf函数定义可信集。为每个变异分配一个因果后验概率，并报告p值；然后按概率降序对变异进行排序，并包含在可信集中，直到累积和达到95%。使用Linda数据库中报告的信息对先导全基因组显著变异进行eQTL搜索。
结果
研究人员分析了1,968名接种了两剂辉瑞-BioNTech疫苗且无先前感染证据的选定个体样本集中的anti-S IgG水平，通过排除N蛋白血清阳性结果的个体来确定。Anti-S IgG水平的中位数为802 BAU/ml（范围：4.81-39,800 BAU/ml；平均值：1,351.83 BAU/ml；IQR：1,267 BAU/ml）。研究人员观察到anti-S IgG滴度的下降与两次注射之间经过的时间成正比。还发现IgG水平与年龄呈负相关，与BMI呈正相关。此外，与先前报告一致，发现非吸烟者的IgG滴度高于吸烟者。与另一项研究相反，观察到女性的水平显著高于男性。
为了识别与SARS-CoV-2疫苗接种后anti-S IgG水平变异相关的遗传多态性，研究人员进行了GWAS，测试了超过800万个标记。性别、年龄、BMI、吸烟状况以及第二次疫苗接种与采血之间的时间作为协变量包含在线性回归模型中。
在确认数据中不存在群体分层后（λ = 1.006），研究人员在3号染色体上CMTM8基因的内含子区域识别出一个新的全基因组显著关联信号。先导变异rs7643677的C等位基因与疫苗接种后降低的anti-S IgG水平相关（效应值=-0.099个标准差单位，p值 = 2.095×10-8）。条件分析显示在该区域没有与anti-S IgG水平显著相关的额外信号，表明由rs7643677主导的信号完全解释了观察到的关联。精细定位分析赋予rs7643677为因果变异的概率为38%。
为了研究anti-S IgG水平遗传关联背后的生物学机制，研究人员评估了先导SNP是否已被报告为该区域基因的表达数量性状位点（eQTL）。发现rs7643677与SNP rs6550109处于高LD（r2= 0.98），rs6550109是全血中CMTM8的已知eQTL（p值 = 6.24×10-130），其中rs6550109-T等位基因（对应于rs7643677-C）与增加的CMTM8表达相关。此外，据报道rs6550109-T在单核细胞中影响CMTM8基因表达，无论是在基础条件下还是LPS激活条件下（p值 = 1.05 × 10?13和 p值 =1.03 × 10-16）。值得注意的是，rs6550109位于一个由ENCODE（EH38E2189951）分类的远端增强子样特征中，该元素可以解释调节功能，但需要功能验证。
为了更好地定义与疫苗接种后anti-S IgG水平相关的变异起作用的细胞背景，研究人员测试了CMTM8位点的先导变异是否与在撒丁岛人群3,757名个体样本中评估的731个免疫性状观察到的任何遗传关联共定位（即我们的性状和其中一个免疫性状在CMTM8位点是否共享一个或多个推定的因果变异）。
观察到CMTM8位点anti-S IgG水平的信号与影响PMN-MDSC上粘附分子CD66b表达的信号共定位，共享因果变异（PP-H4）的后验概率为97.5%。为了优先考虑两个信号之间潜在的共享因果变异，计算了区域内每个变异对两种表型（即anti-S IgG水平和MDSC上CD66b表达）均为因果的概率。发现CD66b在MDSC上表达的先导变异rs12496184有83%的概率影响两种性状，而rs7643677有15%的概率。两个先导变异rs7643677和rs12496184的等位基因对两种表型具有相反的效应，anti-S IgG的增加对应于PMN-MDSC上CD66b的减少。PMN-MDSC是髓系来源的多样化细胞群，具有未成熟表型和强大的抑制适应性免疫细胞群的能力。鉴于CD66b是公认的粒细胞标记，研究人员使用来自SardiNIA研究队列约2,000份免疫表型分析样本的原始流式细胞术数据分析了其在粒细胞群体内的表达。对新评估的粒细胞数据进行CMTM8基因的单一位点遗传关联分析未产生显著结果（p值=0.83），表明CMTM8关联仅限于PMN-MDSC细胞类型。
除了CMTM8基因的新信号外，研究人员还证实了anti-S IgG水平与人类白细胞抗原（HLA）区域变异的关联，其中先导变异rs2596436（p值 = 7.709×10-9）定位在HLA-B基因上游几个kb处。Esposito及其同事在同一区域报告的先导变异（rs2428479和rs28366135）与rs2596436处于强LD（r2= 0.98）并显示出相同的效应方向。在rs2596436周围+/- 100 kb区域进行条件分析后，未发现其他全基因组显著信号。然而，发现了两个额外的提示性独立关联（p值<10-6），由rs4472395和rs111337511主导。值得注意的是，rs4472395与同一工作中的顶级变异（rs1632893）处于中度LD（r2= 0.61）。
然后搜索了HLA区域内与anti-S IgG水平相关的eQTL。发现rs2596436与rs2596574处于强LD（r2= 0.98），rs2596574是大脑中MICA基因的eQTL（p值= 5.26×10-10）。rs2596574-A等位基因（对应于rs2596436顶级变异T等位基因）与降低的MICA表达相关，而rs2596436-T与增加的anti-S IgG水平相关。此外，rs2596436被鉴定为血液中HLA-B、SKIV2L和DDR1的eQTL（p值 = 1.20 × 10 -31，p值 = 1.13 × 10 -11，和 p值 = 2.32 ×10-20）。
HLA区域的先导变异rs2596436不存在于Orrù及其同事的免疫表型数据集中。因此，使用rs2523527作为代理（在欧洲人群中与rs2596436的r2= 1）。然后在rs2523527周围+/- 100 kb区域进行共定位分析；观察到共享因果变异的最高后验概率是幼稚双阴性（CD4neg CD8neg）T细胞（PP-H4 = 89%）。rs2523527-G等位基因与循环中幼稚双阴性T细胞水平增加以及BNT162b2疫苗接种后anti-S IgG产生增加相关。幼稚双阴性T细胞是T细胞谱系中的一个次要群体，其在免疫系统中的作用尚未被认识。然而，它们在炎症性风湿性疾病（包括自身免疫性淋巴增殖综合征和系统性红斑狼疮）中的扩增导致了其具有促炎作用的假设。
讨论
本研究通过GWAS调查了宿主遗传因素对意大利无先前病毒暴露个体队列中SARS-CoV-2疫苗接种后anti-S免疫球蛋白G水平的影响。原始研究队列的大规模使研究人员能够应用严格的样本选择标准，从而仅纳入无先前感染血清学证据且接受了两剂BNT162b2疫苗的个体。这种数据过滤过程虽然将总样本量减少了72.5%（从7,169人减少到1,968人），但有效最小化了队列内的异质性和噪声，从而增强了我们检测针对SARS-CoV-2 BNT162b2疫苗接种反应特异性关联信号的能力。
样本量的减少是预期的，因为在意大利国家领土上可获得多种类型的COVID-19疫苗。事实上，在意大利接种的1.28亿剂COVID-19疫苗中，64%是BNT162b2（辉瑞-BioNTech），24%是Spikevax（Moderna），10%是Vaxzevria（阿斯利康），1%是Jcovden（强生杨森）。此外，与我们的数据一致，只有部分接种了两剂疫苗的人群（80%）两次接种了相同类型的疫苗。
我们对1,968份选定样本中anti-S IgG值的GWAS识别出一个由SNP rs7643677主导的新信号，其C等位基因与疫苗接种后降低的anti-S IgG水平相关。rs7643677位于CMTM8基因的内含子区域，该基因属于趋化因子样因子基因超家族，参与肿瘤抑制和细胞迁移。
先导变异rs7643677的eQTL分析支持其在先天性和适应性免疫中对CMTM8表达的影响。与人类免疫表型分析数据的共定位分析进一步提示其对PMN-MDSC上CD66b表达的影响。这些细胞代表了人类和小鼠中MDSC的两个主要群组之一，根据其来自粒细胞髓系细胞谱系进行分类。最近，它们的积累已被确定为COVID-19疾病严重程度的预测因子。
虽然大多数研究集中在癌症上，如结肠癌、胰腺癌和胃癌，但关于CMTM8对免疫细胞的具体作用知之甚少。最近的一项研究表明，CMTM8与CD8+ T细胞、中性粒细胞和树突状细胞呈负相关，并提示CMTM8可能通过TGF-β和Notch途径参与促进上皮-间质转化过程并形成免疫抑制微环境。此外，在寻找作为HIV-1获得性决定因素的宿主遗传因素背景下，观察到了CMTM8基因的提示性参与。然而，据我们所知，尚无现有文献将CMTM8基因变异特别与粒细胞功能或MDSC扩增联系起来。尽管这些细胞通常与病理状况相关，但大量证据也支持MDSC在生理性、非病理环境（如疫苗接种）中的作用，它们可以限制疫苗功效。事实上，第一个证明PMN-MDSC在免疫接种过程中参与的研究发表于2008年，使用的是二价沙门氏菌疫苗。在SARS-CoV-2感染或疫苗接种期间，早期的炎症激活可能主要驱动外周组织中PMN-MDSC的发展。这一假设得到了eQTL数据的支持，该数据显示变异rs12496184影响肺组织中的CMTM8表达（p值=1.2×10-5），这是SARS-CoV-2感染开始的部位。肺组织也对单独的SARS-CoV-2刺突蛋白作出反应，即使在没有其他病毒成分的情况下也会触发细胞信号级联。
我们的研究通过提出一种潜在的遗传、体液和细胞因素之间的相互作用，有助于理解影响疫苗接种功效的复杂过程，这些因素是BNT162b2疫苗反应的基础。
详细来说，我们关于anti-S IgG水平与CMTM8遗传关联机制背后的假设可以总结如下：i) 由rs7643677主导的信号通过一个共定位变异rs12496184影响PMN-MDSC上激活标记CD66b的表达，其G等位基因与这些细胞上CD66b表达增加相关，从而增强其抑制活性（CD66b被公认为粒细胞激活标记）；ii) 因此，在存在rs12496184-G等位基因的情况下，B细胞分化效果较差，产生较低水平的anti-S IgG；iii) 同时，在携带rs7643677-C等位基因的个体中，接种BNT162b2后观察到较低的anti-S IgG产生。
值得注意的是，在我们的数据集中，CMTM8关联似乎仅限于PMN-MDSC细胞类型。鉴于CD66b是公认的粒细胞标记，我们最初假设观察到的CMTM8与PMN-MDSC上CD66b表达之间的遗传关联可能反映了与粒细胞主要关联的残余效应。然而，对约2,000份样本的粒细胞流式细胞术分析并不支持这一点。实际上，CMTM8位点与粒细胞性状的遗传关联分析未产生显著结果。
有趣的是，在COVID-19宿主遗传学倡议研究中，观察到rs7643677与"疾病严重程度"性状存在名义上的显著关联，其C等位基因与发生严重症状或通常需要住院治疗的风险较高相关（效应大小 = 0.026，p值=6.48×10-3）。一致地，在我们的数据中，rs7643677-C与较低的anti-S IgG水平相关。
