《New Phytologist》：Symbiosis-associated UMAMIT transporters required for establishing efficient nitrogen fixation in Medicago truncatula
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本研究揭示了蒺藜苜蓿中五个共生相关UMAMIT氨基酸转运蛋白（MtUMAMIT14/17/36/37/66）在根瘤固氮中的核心功能。通过CRISPR-Cas9技术构建三重突变体证明，这些转运蛋白通过定位于共生体膜、侵染线膜及维管组织，介导氨基酸跨膜运输以维持根瘤发育和氮固定效率。研究为理解豆科植物-根瘤菌共生系统的营养交换机制提供了新视角。
共生相关UMAMIT氨基酸转运蛋白在蒺藜苜蓿根瘤固氮中的功能解析
引言背景
豆科植物与根瘤菌在约60-100百万年前共同进化出共生关系，形成具有固氮能力的根瘤。在共生建立初期，根瘤作为碳汇器官依赖宿主提供的营养支持根瘤菌增殖；成熟后，根瘤菌将大气氮固定为氨并合成氨基酸供植物生长。氨基酸作为氮的主要运输形式，其跨膜转运机制尤其是通过USUALLY MULTIPLE ACIDS MOVE IN AND OUT TRANSPORTERS（UMAMITs）家族的作用尚不明确。
共生相关UMAMIT基因的鉴定与表达模式
通过转录组分析和系统发育研究，筛选出五个在根瘤菌侵染早期（48小时内）被特异性诱导的共生相关UMAMIT基因：MtUMAMIT14、-17、-36、-37和-66。这些基因的表达依赖结瘤因子（Nod factor）感知，在超结瘤基因型sickle（skl）中诱导强烈，而在结瘤因子受体突变体lyk3和nfp中几乎无诱导。启动子-GUS融合实验显示，MtUMAMIT14在根瘤过渡区表达，MtUMAMIT17在根瘤II区、III区、维管组织广泛表达，MtUMAMIT36定位于III区侵染细胞和内皮层，MtUMAMIT37则在根瘤分生组织活跃。
系统发育分析与直系同源基因
74个全长MtUMAMIT蛋白与拟南芥、水稻、百脉根和大豆的UMAMIT进行系统发育分析，分为10个进化枝。共生相关UMAMIT主要聚集于Clade I（含MtUMAMIT14/17，与拟南芥中参与氨基酸装载的UMAMIT同源）和Clade III（含MtUMAMIT36/37，为豆科特异扩增分支）。Clade III成员在百脉根（LotjaGi4g1v0029900）和大豆（Glyma.08G076800）中同样显示共生相关表达，表明其在豆科植物根瘤中功能保守。
三重突变体的构建与表型分析
利用CRISPR-Cas9技术构建MtUMAMIT14/17/36三重突变体（两个独立株系a和b）。突变体根瘤菌侵染过程无异常，但接种三种根瘤菌（高效菌株Sinorhizobium medicaeABS7M、中效S. meliloti2011、低效S. meliloti1021）后，固氮酶活性（ANA）下降高达41%，植株生物量降低82%，根瘤血红蛋白含量减少52%。突变体叶片出现氮饥饿症状：叶绿素含量下降30%-60%，花青素和黄酮醇含量升高，根瘤III区淀粉异常累积。
氨基酸代谢谱改变
在ABS7M接种条件下，突变体根瘤中总氨基酸含量显著降低，天冬酰胺（Asn）——主要固氮运输氨基酸——在叶片和根瘤中分别减少86%和78%。接种效率较低的根瘤菌时，氨基酸缺陷表型更显著，说明UMAMIT功能在低效共生背景下尤为关键。
MtUMAMIT17的亚细胞定位机制
通过MtUMAMIT17特异性抗体进行免疫定位发现：在根瘤II区细胞中，MtUMAMIT17定位于细胞外周；在III区侵染细胞内，该蛋白重定位至共生体膜呈杆状结构，而未侵染细胞中仍为外周定位。此外，MtUMAMIT17在根瘤维管组织（韧皮部、木质部薄壁细胞）及邻近根维管中富集，在侵染线膜中亦有分布。Western blot验证该蛋白在接种后2-10天的根瘤中特异性表达。
讨论与进化意义
共生相关UMAMITs在根瘤发育全阶段活跃：早期支持根瘤菌增殖，成熟期介导氨基酸从共生体向宿主细胞质输出，以弥补根瘤菌共生营养缺陷型；同时通过维管组织运输固定氮产物。MtUMAMIT17从细胞外周向共生体膜的靶向转换与液泡膜蛋白TIP1g的定位变化类似，暗示共生体膜具有质膜和液泡膜双重特性。该研究揭示了UMAMIT家族基因在共生固氮进化中被招募至根瘤发育程序，为人工设计非豆科植物-微生物共生系统提供了理论依据。
